PCR检测原发肝癌YNZ22位点VNTR的杂合性丢失

世界华人消化杂志 1998年第2期第0卷 研究原著

作者：杜青书　房殿春　罗元辉　刘为纹

单位：第三军医大学西南医院消化科　重庆市　400038

关键词：肝肿瘤/遗传学；染色体，人，17对；小卫星重复；杂合子；染色体缺失

PCR detection of heterozygosity loss at YNZ22 locus containing VNTR segment in hepatocellular carcinoma

　　dU Qing-Shu, FANG Dian-Chun, LUO Yuan-Hui and LIU Wei-Wen

　　Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

　　Subject headings　liver neoplasms/genetics; chromosomes, human, pair 17; minisatellite repeats; heterzygote; chromosome deletion

　　Abstract

　　AIM　To evaluate the role of heterozygosity (LOH) loss at YNZ22 locus in the development of hepatocellular carcinoma.

　　METHODS Polymorphic analysis of YNZ22 locus that contains a variable number of tandem repeat (VNTR) was performed in 35 surgically resected specimens of hepatocellular carcinomas and adjacent normal tissues by the polymerase chain reaction(PCR).

　　RESULTS Constitutional heterozygosity (informative) was found in 25/35 (71.4%) of hepatocellular carcinomas. Loss of heterozygosity (LOH) at YNZ22 locus was detected in 48.0% of informative cases. No significant difference existed between LOH at YNZ22 and serum levels of HBsAg and AFP,histological grades, tumor size and distant metastasis (P＞0.05).

　　CONCLUSION LOH at YNZ22 locus is a common change in hepatocellular carcinomas and may be involved in carcinogenesis of hepatocellular cancer.

　　中国图书资料分类号　R735.7

　　摘　要

　　目的　探讨YNZ22位点串联重复序列(VNTR)的杂合性丢失在原发肝癌发生发展中的作用.

　　方法　应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增35例原发肝癌和正常肝组织YNZ22位点的VNTR区，对原发肝癌的杂合缺失进行分析.

　　结果　原发肝癌35例，属信息个体25例，占71.4%. 信息个体中25例检出YNZ22位点杂合缺失(LOH)12例，杂合缺失率为48.0%. 分析LOH与临床病理参数间的关系发现，原发肝癌YNZ22位点杂合缺失与血清HBsAg和AFP水平、组织学分级、肿瘤大小及远处转移无关.

　　结论　YNZ22位点杂合缺失是原发肝癌的常见改变，可能参与了原发肝癌的发生与发展.

　　0　引言

　　恶性肿瘤经常发生特定染色体区域的丢失，染色体17p的某些位点是最常见的丢失区域之一^［1］. 数目可变的串联重复序列(variable number of tandem repeat, VNTR)为一类新的遗传标记，以同一短序列重复串联为特征^［2］. 近年，在染色体17p^13.3(YNZ22) 发现了VNTR区，由于该区域与抑癌基因p53基因连锁，并具有多态的性质，因此常被作为标记基因用于肿瘤杂合性丢失(Loss of heterozygosity, LOH)的研究. 作者采用多聚酶链反应(PCR)扩增YNZ22位点的VNTR片段，对肝细胞癌(HCC)的LOH进行分析.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　我院1994-06/1996-06手术切除HCC标本35例，手术切下后立即收集癌组织和手术切缘处的正常组织，剔除出血、坏死部分，－80℃冻存. 按文献方法提取基因组DNA^［3］. 冰冻切片染色证实所检测癌组织肿瘤细胞数均在50%以上.

　　1.2　PCR扩增　取1μg组织DNA，加入20μl PCR反应液中(含10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂, 12.5pmol/L 上游及下游引物；dATP，dTTP,dCTP和dGTP各200μmol/L，以及Taq DNA聚合酶2U)，PCR扩增仪上扩增，反应条件：于95℃保温5min后，94℃变性40s，56℃复性40s,72℃ 延伸60s，循环35次.最后一个循环后，试管仍置72℃继续反应10min. 所用VNTR片段扩增引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成，YNZ22(17p13.3)引物序列如下^［4］：

　　5′-CACAGTCTTTATTCTTCAGCG-3′

　　5′-CGAAGAGTGAAGTGCACAGG-3′

　　1.3　VNTR的PCR分析　取扩增产物10μl，30g/L琼脂糖凝胶进行电泳分离，溴乙锭染色，紫外光下观察并照相. 正常组织经电泳分离如显现两条电泳带者(170bp～780bp)为杂合子(信息个体)，若仅为一条带者为纯合子(非信息个体). 对信息个体癌组织DNA以同样的引物进行PCR分析，比较同一个体癌组织及正常组织DNA扩增片段大小及量的差异，就可推算出是否存在LOH.

　　2　结果

　　2.1　PCR分析　HCC组织VNTR HCC 35例，组织DNA经PCR分析，YNZ22(17p13.3)位点属信息个体25例，检出LOH 12例，占信息个体的48.0%(图1).

　　图1　PCR检测原发肝癌YNZ22位点VNTR的杂合性丢失

　　例1为杂合子；例2为杂合缺失；例3为纯合子(非信息个体)

　　表1　YNZ22位点的LOH与临床病理参数的关系

　　2.2　LOH与临床病理参数　将25例HCC信息个体按血清HBsAg和AFP水平、有无肝硬变、肿瘤分化程度、大小和有无肝外转移的不同进行分组，YNZ22位点LOH率在各组间均无显著差异(P＞0.05，表1).

　　3　讨论

　　HCC的发生发展是一个涉及到多种遗传物质改变的复杂过程，它至少涉及到癌基因N-ras,C-myc，抑癌基因p53和Rb的异常. 作者采用PCR技术，对HCC YNZ22位点中VNTR的多态性进行分析，观察到YNZ22位点的LOH率为48.0%. 结果提示，YNZ22位点LOH是HCC的常见改变，可能参与了HCC的发生、发展

　　YNZ22位于人类第17号染色体短臂17P^13.3p53基因远端，是由70bp的重复单位组成的串联重复序列^［4］. 由于YNZ22与p53基因连锁，故常常用此位点LOH来代表p53基因的LOH. 近年研究发现，虽某些个体p53基因正常，但YNZ22却有LOH，提示该位点可能存在尚未克隆出来的抑癌基因^［5］. YNZ22的VNTR呈现高度多态性，YNZ22的群体杂合率为86%^［2］，本组为71.4%. 通过分析，YNZ22 LOH与临床病理参数的关系显示，YNZ22 LOH与血清HBsAg和AFP水平、组织学分级、肿瘤大小及肝外转移之间并无显著相关关系.

　　以往检测YNZ22位点的LOH多采用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析，本文采用PCR技术，选择VNTR两侧的序列合成引物，对DNA靶序列进行扩增，然后通过凝胶电泳，溴乙锭染色扩增片段，对VNTR位点的多态性进行分析. 此方法简便、灵敏，实验周期短，无需同位素，尤其适用于微量样品和大样本研究，具有良好的应用前景.

　　杜青书，男 ，1964-08-23生，重庆市合川县人，汉族. 1986年第三军医大学医疗系本科毕业，主治医师，讲师，主要从事消化病诊治研究，发表论文3篇.

　　通讯作者　杜青书，400038，第三军医大学西南医院消化科，重庆市沙坪坝区高滩岩正街1号.

　　Correspondence to: Dr. DU Qing-Shu, Department of gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, 1 Gaotanyan Zhengjie, Shapingba District, Chongqing 400038, China

　　Tel. +86*23*65318301-73094

　　收稿日期　1997-09-23　修回日期　1997-10-29

　　4　参考文献

　　1　Watatani M, Yoshida T, Kuroda K, Leda S, Yasutomi M. Allelic loss of chromosome 17P, mutation of the p53 gene, and microsatellite instability in right-and left-sided colorectal cancer. Cancer, 1996;77(Suppl 8):1688-1693

　　2　Horn GT, Richards B, Klinger KW. Amplification of a highly polymorphic VNTR segment by the PCR. Nucleic Acides Res, 1989;17(5):2140-2143

　　3　王东旭，房殿春，罗元辉，刘为纹. 胃癌组织大肠癌丢失基因杂合性丢失及表达缺失的研究. 中华肿瘤杂志，1996；18(5)：331-334

　　4　Fearon ER, Vogelstein BA. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 1990;61(3):759-767

　　5　Saxena A, Clark WC, Robertson JT, Ikejiri B, Oldfield EH, Ali IU. Evidence for the involvement of a potential second tunmor suppressor gene on chromosome 17 disrinct from p53 in malignant astrocytoas. Cancer Res, 1992;52(23):6716-6721