用荧光原位杂交技术研究慢性粒细胞性白血病变异Ph染色体易位的形成
北京医科大学学报 1999年第5期第31卷 论著
作者：洪 波 邱镜滢 党 辉 师 岩 何 琦 陆道培
单位：北京医科大学人民医院血液病研究所，北京 100034
关键词：白血病；粒-单核细胞；慢性；遗传学；原位杂交；荧光；染色体畸变；变异(遗传学)；Ph染色体
摘 要 目的:研究慢性粒细胞性白血病(chronic myeloid leukemia, CML)变异Ph染色体的形成。方法:应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术，以9号、15号、22号整条染色体DNA探针和M-bcr/abl易位探针检测7例具有变异Ph染色体的CML病人骨髓中期分裂相及间期细胞。结果:所有变异Ph染色体易位至少涉及3条染色体，并由标准Ph染色体易位t(9;22)(q34;q11)衍生而来。结论:FISH技术比传统细胞遗传学方法更敏感，能准确分析变异Ph染色体及其形成过程。
中国图书资料分类法分类号 R733.72
Application of fluorescence in situ hybridization in detecting the formation of variant Philadelphia translocation in chronic myeloid leukemia
HONG Bo, QIU Jing-Ying, DANG Hui, SHI Yan, HE Qi, LU Dao-Pei
(Institute of Hematology, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
MeSH Leukemia, myelomonocytic, chronic/genet In situ hybridization, fluorescence Chromosome aberrations Variation(Genetics) Philadelphia chromosome
ABSTRACT Objective: To detect the formation of variant Philadelphia translocation in chronic myeloid leukemia (CML).Methods: Whole chromosome specific DNA probe for chromosome 9,15,22 and M-bcr/abl translocation probe were used to detect variant Ph chromosome in metaphase and interphase nuclei of 7 CML patients by FISH.Results: All variant Ph translocation involved at least three chromosomes and derived from a standard Ph translocation t ( 9 ; 22 )(q34 ; q11).Conclusion: FISH is more sensitive than the conventional cytogenetic method and can be applied to the accurate analysis of variant Ph translocation and the process of its formation.
(J Beijing Med Univ, 1999,31:400-403)
Ph染色体是慢性粒细胞性白血病(chronic myeloid leukemia, CML)特有的染色体异常，是9号与22号染色体易位所致，5%～10%Ph染色体阳性CML患者具有与 标准易位t ( 9 ; 22 ) ( q34; q11) 不同的变异易位［1］。由于变异Ph染色体易位的多样性，用传统细胞遗传学带型分析的方法进行准确检测存在一定困难，荧光原位杂交技术的开展，提高了对染色体畸变检出的敏感性，对变异易位的划分及形成过程能够更准确地认识，有利于进一步了解变异 Ph 染色体的性质及在CML病程中的作用, 为此本研究采用中期分裂相和间期细胞荧光原位杂交( fluorescence in situ hybridization, FISH ),并结合带型分析对7例CML病人的变异Ph染色体进行了分析。
1 材料与方法
病例选择及染色体标本制备、带型分析: 7例患者形态学按FAB标准诊为CML,患者均处于慢性期，患者骨髓血经24 h短期培养，培养终止前2 h加入秋水仙素，常规收获、固定后进行G显带分析［2］，剩余标本滴片后置－20 ℃保存，待原位杂交用。
荧光原位杂交：所用探针为地高辛(Digoxigenin)标记的9号与22号染色体全长探针(Oncor公司),生物素( Biotin)标记的15号染色体全长探针(质粒DNA为Dr. Speicher赠送，探针纯化、标记见文献［3］),以及双色(橙色与绿色)荧光素直接标记的M-bcr/abl DNA探针(美国陈忠博士赠送)。原位杂交方法参照Pinkel等方法加以改进。
9号与22号染色体全长探针杂交的标本以FITC偶联的抗地高辛抗体检测，15号染色体全长探针杂交的标本以FITC偶联的抗生物素抗体检测，最后加入含PI和DAPI的抗淬灭剂及盖玻片于荧光显微镜下观察，用470～500 nm蓝光激发，染色体、间期细胞呈红色，杂交信号为黄色；用330～370 nm紫外光激发时，染色体及细胞呈蓝白色，形态清晰。双色荧光素(橙色与绿色)直接标记的M-bcr/abl 探针杂交的标本，经杂交后洗片，并加入含DAPI Ⅱ的抗淬灭剂和盖玻片后，用可激发DAPI/TRITC/FITC的三色滤光块观测，细胞及染色体呈灰蓝色，9号染色体q34处可见绿色点状杂交信号，22号染色体q11处可见红色杂交信号，间期细胞中亦可见相应的杂交信号。若9号与22号染色体正常，则可见彼此分离的2个红色点状杂交信号及2个绿色点状信号。在具有t(9;22)易位的间期细胞中，可见1个红色点状信号、1个绿色点状信号和1个红绿点紧靠在一起或相互叠加产生的黄色点状信号，用ASA1600 Kodak彩色胶卷拍照记录。
2 结果
7例患者G显带分析、FISH结果以及应用的探针见表1及图1～9。
表1 7例CML患者G显带和荧光原位杂交结果
Table 1 G-banding and FISH results of 7 patients with CML
| Case |
G-banding |
FISH |
| Results |
No. of
metaphase
analyzed |
Results |
No. of
metaphase
analyzed |
Probes used |
| 1 |
46,XY,t(9;9;22) |
23 |
46,XY,t(9;9;22) |
65 |
WCP for chromosome 9,22 |
| 2 |
46,XX,t(5;9;15;22) |
25 |
46,XX,t(5;9;15;22) |
56 |
WCP for chromosome9,22,15 |
| 3 |
46,XY,t(10;12;22) |
31 |
46,XY,t(9;12;22) |
37 |
WCP for chromosome9,22 |
| 4 |
46,XY,t(11;22) |
20 |
46,XY,t(9;11;22) |
38 |
WCP for chromosome9,22; |
| |
|
|
|
30 |
M-bcr/abl DNA probe |
| |
|
|
|
500(I)* |
|
| 5 |
46,XX,t(5;9;22) |
30 |
46,XX,t(5;9;22) |
100 |
WCP for chromosome9 |
| 6 |
45,X,－Y,t(14;22) |
20 |
45,X,－Y,t(9;14;22) |
67 |
WCP for chromosome9,22; |
| |
|
|
|
30 |
M-bcr/abl DNA probe |
| |
|
|
|
500(I)* |
|
| 7 |
46,XY,t(19;21;22) |
28 |
46,XY,t(9;19;21;22) |
124 |
WCP for chromosome9,22; |
| |
|
|
|
30 |
M-bcr/abl DNA probe |
| |
|
|
|
500(I)* |
|
WCP: whole chromosome probe; (I)*interphase nuclei.
图1 例3用9号染色体全长探针杂交。a,b: 9号染色体；c: Ph染色体；e: 参与易位的12号染色体。
Figure 1 Painting probe for chromosome 9 displays the presence of signals on two chromosome 9(a,b); Ph chromosome(c); one der(12)(e).
图2,3 例4分别用9号(图2)、22号(图3)染色体全长探针杂交。a,b: 9号染色体; c: Ph染色体; d: 正常22号染色体;e: 参与易位的11号染色体短臂。
Figure 2,3 Painting probes for chromosome 9(Fig.2) and chromosome 22(Fig.3) display the presence of signals on two chromosome 9(a,b);Ph chromosome(c);one normal chromosome 22(d) and p arm of der(11) (e).
图4,5 例6分别用9号(图4)、22(图5)号染色体全长探针杂交。a,b: 9号染色体；c: Ph染色体；d: 正常22号染色体；e: 参与易位的14号染色体。
Figure 4,5 Painting probes for chromosome 9(Fig.4) and chromosome 22(Fig.5)display the presence of signals on two chromosome 9(a,b);Ph chromosome(c);one normal chromosome22(d);one der(14) (e).
图6,7 例7分别用9号(图6)、22(图7)号染色体全长探针杂交。a,b: 9号染色体；c: Ph染色体；d: 正常22号染色体；e: 参与易位的19号染色体；f: 参与易位的21号染色体。
Figure 6,7 Whole chromosome probes for chromosome 9 (Fig.6) and chromosome22(Fig.7) show the presence of signals on two chromosome 9(a,b);Ph chromosome(c);one normal chromosome 22(d);one der(19) (e);one der(21) (f).
图8,9 用M-bcr/abl探针杂交，可见分别代表abl基因、bcr基因的绿色、红色点状信号以及代表M-bcr/abl融合基因的黄色点状信号。(图8)间期细胞；(图9)中期分裂相。
Figure8,9 Analysis using M-bcr/abl probe in interphase nuclei (Fig.8) and metaphase(Fig.9). Small green and red signals indicate abl and bcr gene respectively .A M-bcr/abl fusion gene is indicated by a yellow signal.
其中例1、例2、例5 G显带与FISH结果一致。例1用9号染色体探针杂交后，2条9号染色体及Ph染色体有杂交信号。其中1条9号染色体长臂较长，而另一条9号染色体短臂有部分从其它染色体易位来的红色片段，经22号染色体探针验证，为参与易位的22号染色体长臂。因此推测1条9号染色体与22号染色体先发生易位t(9;22), 然后参与易位的9号染色体der(9)长臂又与第2条9号染色体短臂发生相互易位，使der(9)上的22号染色体部分长臂易位至第2条9号染色体的短臂上，形成t(9;9;22)。
例2经3种探针杂交检测表明：首先进行t(9;22),第2步易位至9号染色体上的部分22号染色体长臂又易位至15号染色体短臂上,形成15p+,第3步该9号染色体部分长臂继续与5号染色体短臂发生易位。
例5采用9号染色体探针杂交证实：易位中先进行t(9;22),然后der(9)长臂再与5号染色体长臂进行易位。
例3、例4、例6、例7 G显带9号染色体未见异常， FISH结果却提示9号染色体参与了易位。
例3用9号染色体探针杂交后2条9号染色体，Ph染色体及1条C组染色体长臂靠近末端处有杂交信号(图1)，结合G显带，该C组染色体为易位后的12号染色体。用22号染色体探针杂交1条22号染色体、Ph染色体和1条12号染色体长臂末端有杂交信号。FISH结果提示该例染色体易位涉及了9号染色体，过程如下：第1步进行t(9;22)，第2步参与易位的9号染色体长臂与12号染色体长臂发生相互易位，形成t(9;12;22)。
例4、例6、例7 以9号染色体探针进行杂交，3例标本除2条9号染色体外，Ph染色体亦有少量荧光信号，例7尚有1条E组染色体有荧光信号(根据G显带为19号染色体)(图2,4,6)，证实9号与22号染色体发生了易位。进一步用M-bcr/abl探针进行杂交，3例标本各观察500个间期细胞和30个中期分裂相，90%以上间期细胞及所有分裂相中存在红色与绿色荧光信号叠加后形成的黄色点状信号(图8,9)，表明9号与22号染色体发生了易位。分别再以22号染色体探针进行杂交，3例中除22号、Ph染色体外都存在第3条有荧光信号的染色体(图3,5,7)，结合G显带结果例4为11号染色体、例6为14号染色体、例7为21号染色体，其易位分别是:例4 t(9;11;22);例6 t(9;14;22);例7 t(9;19;21;22)。3例标本染色体易位均先进行t(9;22)，然后der(9)再与第3条染色体易位；例7则与第3、第4条染色体易位，即der(9)上部分22号染色体片段与21号染色体易位，第2次易位后的9号染色体再与19号染色体易位，使部分9号染色体片段易位至19号染色体长臂末端。
3 讨论
传统细胞遗传学的显带技术对变异Ph染色体的检测常常受染色体形态、带型好坏及检测人员技术的影响，对明确变异易位形成的过程也存在很大的局限性。传统细胞遗传学曾将变异易位划分为(1)简单变异易位,即易位涉及22号和除9号染色体以外的1条染色体；(2)复杂易位,即易位涉及9号、22号和其它1条或多条染色体。本文例4、例6 G显带结果为t(11;22)、t(14;22),易位未涉及9号染色体，按上述标准可定为简单变异易位。经9号染色体探针检测，初步证实9号染色体参与了易位。而M-bcr/abl DNA探针杂交结果进一步表明，这2例患者存在M-bcr/abl融合基因，发生的9号与22号染色体易位断裂点与标准易位的断裂点一致。各有3条染色体参与了易位。比较上述2例9号染色体探针杂交结果，可以看到2条9号染色体上未见明显的从其它染色体易位来的片段，而Ph染色体上却有少量9号染色体片段，这种细微异常用G显带的方法是无法检出的。因此传统细胞遗传学所确定的简单Ph染色体变异易位，可能因第2次易位至9号染色体上的其它染色体片段小、带纹不清晰，常规带型分辨敏感度有限，未能发现9号染色体参与了易位，并以此作为简单变异Ph染色体易位的特点之一。随着FISH技术的发展，越来越多的事实表明：简单变异Ph染色体易位，实际上均为复杂易位且涉及3条以上染色体［4］。
例3、例7 G显带未发现9号染色体有异常，FISH结果证实9号染色体参与了易位。最初G显带结果没有发现9号染色体参与易位，主要是染色体形态差，影响了带型分析的准确性。
本研究中7例患者全部采用9号染色体探针杂交，Ph染色体上均可见少量易位至此的9号染色体片段；而用22号染色体探针进行杂交，结果显示22号染色体部分片段位于参与易位的第3条染色体上，提示变异Ph染色体易位，首先进行t(9;22)(q34;q11)标准易位，然后参与标准易位的9号染色体再次与其它染色体发生易位，整个过程包括至少连续2次易位，共发生4次以上染色体断裂，表明变异Ph染色体易位均由标准t(9;22)易位发展而来。Calabrese等［5］用9号、22号全长染色体探针以及D22S1、D22S15、3′abl、5′bcr探针研究了10例复杂变异Ph染色体易位CML患者，证实易位过程中发生了9号与22号染色体相互易位，导致M-bcr-abl基因重排，并推测标准t(9;22)可能发生于具有变异Ph染色体的CML患者诊断前的无症状期。
变异Ph染色体易位最初被认为多存在于CML病人急变期，随着细胞遗传学研究的不断深入，现已明确变异Ph染色体可存在于CML病人病程的各个时期［4］。本文7例病人初次进行细胞遗传学检查时均为慢性期，例3确诊CML 2年即发生急变，例6行异基因骨髓移植后8个月，细胞遗传学、血液学复发，其余患者仍为慢性期。例3急变、例6 BMT后复发时间较早，是否与变异Ph染色体易位有关尚不清楚。对于变异易位中第3条染色体的参与所产生的临床效应，仍需积累更多资料进行研究，但与标准易位一样，这些患者存在核型进一步演变的可能［5］。
通过7例变异Ph染色体的研究，我们体会到FISH技术对染色体异常的检出比传统细胞遗传学更敏感，不同染色体探针的使用减少了染色体形态、数量对结果的影响，相对稳定的操作过程及清晰的杂交信号，容易掌握、辨认。特别是双色FISH采用染色体易位探针，如M-bcr/abl DNA探针，在缺少中期分裂相时，还可用于间期细胞的检测，并能在短期内分析大量细胞。总之，FISH技术不仅在白血病诊断、治疗过程中起着重要作用，对进一步认识变异Ph染色体的生物学机制也有很大帮助。
参考文献
1 Tosi S, Cabot G, Giudici G, et al. Detection of the breakpoint cluster region-ABL fusion in chronic myeloid leukemia with variant philadelphia chromosome translocations by in situ hybridization. Cancer Genet Cytogenet， 1996,89:153-156
2 邱镜滢，段爱君，党 辉,等. 自体血浆对改善白血病细胞染色体的研究. 北京医科大学学报, 1993, 25(4): 249-281
3 洪 波，邱镜滢，史惠琳,等. 染色体原位抑制杂交在急性早幼粒细胞白血病研究中的应用. 北京医科大学学报, 1998，30(1): 29-31
4 Calabrese G, Palka G, Westbrook CA, et al. Complex translocation involving Ph chromosome in a patient with typical chronic myelogenous leukemia. Cancer Genet cytogenet, 1992, 63: 52-55
5 Calabrese G, Stuppia L, Franchi PG, et al. Complex translocations of the Ph chromosome and Ph negative CML arise from similar mechanisms, as evidenced by FISH analysis. Cancer Genet Cytogenet， 1994,78:153-159
（1998-08-23收稿)
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