TGFβ1基因对肝癌细胞癌基因表达的体外观察
第二军医大学学报1999年第20卷第5期
封岩 曹广文 张晓琴 高峰 孔宪涛
摘 要 目的:观察转化生长因子β1(TGFβ1)转入对人肝癌细胞系癌基因表达的影响。方法:pL（TGFβ1）SN和相应重组病毒上清用脂质体转染包装细胞及肝癌细胞，经G418筛选后，进行免疫组化染色，观察癌基因蛋白表达的改变。结果:提取的TGFβ1cDNA连接物经酶切鉴定，证明有正向插入及反向插入两类。病毒上清TGFβ1含量在16～41ng/ml,套式PCR后均出现290bp条带。转基因后肝癌细胞癌基因蛋白免疫组化染色结果:c-myc，c-met及ras癌基因表达，反向TGFβ1转入者为(+)～(++)，而正向转入均为(-)。免疫组化检测其TGFβ1表达蛋白，空白对照染色(±)，正向则为(++)。结论:正向插入的TGFβ1cDNA可使癌基因c-myc，c-met及ras表达减少，提示它在体外对肝癌细胞具有负调控作用。
关键词：转染生长因子β1 肝肿瘤 癌基因
转化生长因子β1(TGFβ1)为一种细胞因子,通过调节细胞周期因子、转录因子、生长因子、粘附分子和细胞基质基因的启动、转录、降解等环节而实现其促进或抑制细胞生长的功能。现已明确TGFβ1在肝纤维化中起重要作用，它可以引起肝癌的癌细胞凋亡。我们将正、反向插入的TGFβ1［1，2］转入人肝癌细胞，通过TGFβ1的表达，观察癌基因表达的变化，为肝癌基因治疗探讨新方法。
1 材料和方法
1.1 材料 含TGFβ1基因的大肠杆菌(HB101)冻干菌，ATCC产品；逆转录病毒载体pLXSN，美国Fred癌症研究中心Miller博士惠赠；工具酶及DNA分子质量标记等购自华美公司；G418，LipofectamineTM,为美国LifeTechnologies公司产品；Polybrene,Sigma公司产品；RNA抽提试剂，为湖南来福生物工程公司产品；PCR仪，美国PerkinElmer公司产品，2400型；Neo基因内外引物，PA317，Ψ2，SMMC7721及HepGⅠ细胞均由第二军医大学微生物学教研室提供。
1.2 重组逆转录病毒载体的构建 TGFβ1及pLXSN的抽提、纯化、酶切、连接参见《分子克隆》一书，TGFβ1插入位点为EcoRⅠ,插入片段为2.138kb；pLXSN片段为5.8kb，连接后用BamHⅠ及XhoⅠ酶切鉴定插入方向。
1.3 TGFβ1基因的转染及阳性克隆筛选 分别用正、反向pL(TGFβ1)SN在脂质体介导下等量转染PA317，Ψ2，SMMC7721及HepG1细胞，经G418400μg/ml筛选后过滤，吸取阳性病毒上清，在polybrene8μg条件下继续感染包装细胞，48h后吸取第1代病毒液及各代病毒液，感染肝癌细胞方法相同。
1.4 阳性病毒上清TGFβ1的检测 采用GenezymeELISA试剂检测，除样品用1mol/LHCl及1mol/LNaOH活化外，余同一般试剂操作步骤，采用的是双抗体夹心法。
1.5 阳性病毒上清Neo基因检测 抽提病毒上清中的RNA，用套式RT-PCR扩增目的DNA，外引物上游5′-CGTTGTCACTGAAGCGGGAAGG-3′,下游5′-CCATGATATTCGGCAAGCAGGC-3′；内引物上游5′-TGCTATTGGGCGAAGTGCCG-3′,下游5′-ACAAGACCGGCTTCCATCCG-3′。PCR条件:94℃，50℃，72℃均30s,各进行30个循环，产物电泳观察结果。
1.6 阳性克隆玻片制备、免疫组化检测 SMMC7721及HepG1细胞经转染、G418筛选后，待克隆铺满瓶底，传代时加入12mm×50mm薄玻片，培养48h后取玻片用链霉亲和素-辣根过氧化物酶法（S-P法）检测c-myc，c-met及ras基因蛋白。结果判定：阳性切片按阳性细胞数＞5%，25%～45%，＞45%分为(+)，(++)，(+++)3级，c-myc，c-met以细胞核、胞质棕黄着色，而ras以胞质染色为主。
2 结 果
2.1 重组TGFβ1基因的方向鉴定 质粒载体pBR327为5.2kb,其中TGFβ1为2.138kb，载体3.27kb，插入端为EcoRⅠ位点，插入片段从5′端起含以下酶切位点：XhoⅠ（671），PstⅠ（711），BamHⅠ（1718），见图1。TGFβ1插入pLXSN后可产生正向和反向两种形式，通过酶切电泳计算可鉴定其插入方向，用BamHⅠ酶切正向插入者可产生0.42及7.52kb片段，反向则产生1.72及6.22kb片段；用XhoⅠ酶切正向产生1.47及6.47kb片段,反向产生0.67及7.27kb片段。
图1 重组逆转录病毒载体的结构
Fig 1 Structure of recombinant retroviral vectors
LTR: Long terminal repeat; TGF β1: Transforming growth factor β1；
SV: Simian virus; Neo: Neomycin resistant gene
2.2 病毒上清的检测 随机取正、反向TGFβ1感染包装细胞后吸取的阳性病毒上清4份，其中正向3份，反向1份，用ELISA检测其TGFβ1含量，分别为16,41,27及23ng/ml；同时对它们进行Neo基因检测，第1轮PCR后电泳能见2条带，位置在411bp左右，第2轮后电泳均出现条带，位置在290bp左右(图2)。
图2 Neo基因PCR分析结果
Fig 2 PCR analysis of Neo gene
Lane 1,2 and 4: Positive pL(TGFβ1 )SN-PA317 cell culture fluid; Lane
3: Reverse pL(TGFβ1 )SN-PA317 cell culture fluid; Lane 5:
pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA markers; Lane 6～8:Positive pL
(TGFβ1)SN-PA317 cell culture fluid (single primer)
2.3 肝癌细胞系SMMC7721的癌基因免疫组化结果 分别对转染正、反向TGFβ1基因及空载体经筛选后的阳性7721细胞进行免疫组化检测，结果转染空载体者，c-myc表达(++)，c-met为(+++)，ras为(＋)；转染反向TGFβ1基因者c-met表达(++)，余同空载体组；而转染正向TGFβ1基因者，3种癌基因蛋白表达均为阴性。图3显示了部分结果。
图3 SMMC7721细胞转染不同载体后c-myc表达的免疫组化染色结果
Fig 3 Expression of the oncogene c-myc in SMMC 7721,the hepatocellular carcinoma
modified with different vectors by immunohistochemical staining
A:Vacant vector (×2000);B:Reverse TGFβ1(×2000);C:Positive TGFβ1(×100)
2.4 7721细胞的TGFβ1免疫组化结果 用含正向pL(TGFβ1)SN的包装细胞上清感染7721细胞，经G418筛选后对阳性细胞进行TGFβ1表达蛋白的免疫组化分析，并与7721细胞作对照（空白），结果空白对照染色(±)，正向染色(++)。
3 讨 论
TGFβ是一种多功能调节因子，至少有5种亚型，可在多种器官中产生。在肝脏，TGFβ1主要在非肝脏细胞表达，在肝脏及一些肝癌细胞系能引起细胞凋亡。Orsatti等［3］认为，TGFβ在肝癌形成中起作用，他们通过对14例人HCCs进行免疫组化染色，3例（21％）中检测出TGFβ；而Chen等［4］认为TGFβ在肝癌细胞系Hep3B可引起细胞凋亡，并有剂量依赖关系；Gressner等［5］则有不同结果，研究大鼠和人肝癌细胞，通过免疫组化研究TGFβ表达，认为肝细胞有诱导自分泌的能力，并由TGFβ介导凋亡，而肝癌细胞，因它们有TGFβ抗性，可以旁分泌的方式产生TGFβ介导的癌周围肝细胞的凋亡。
我们用正向TGFβ1转染SMMC7721细胞，其免疫组化染色增强，为(++)，而空载体对照则为(±)，说明TGFβ1已转入肿瘤细胞，并表达蛋白，这和ELISA及RT-PCR检测阳性病毒上清中的TGFβ1和Neo基因一样，可以方便、可靠地确定转染是否成功。Factor等［6］认为，在体内和体外TGFβ1是肝细胞生长的潜在性抑制因子，在研究TGFβ1转基因和c-myc/TGFβ1共转基因小鼠时，发现TGFβ1过度表达可引起肝癌形成。Tsai等［7］在系列研究中发现，尿中TGFβ1可以充当肿瘤标志物,尤其在血清中AFP浓度较低时,作为AFP的补充，以区别肝硬化及肝癌，尿中TGFβ1浓度升高，在肝硬化性肝细胞癌时可作为肿瘤标志和预后差的标志。
TGFβ1和TNF，IFN一样［8，9］对多种上皮性肿瘤细胞（肺癌、乳腺癌、结肠癌）的体外增殖起负调节生长作用。有作者［10］在研究肺癌PLA-801D细胞时发现正向TGFβ1可抑制其体内外增殖，机制为转染细胞c-myc基因表达降低，nm23基因表达增加以及诱发细胞凋亡，使得裸鼠体内成瘤率降低，成瘤时间延迟，肿瘤体积缩小。也有作者［11］运用肺腺癌LM3细胞，成瘤后瘤体内注射PMAMneo-TGFβ1质粒DNA（50μg/μl）,结果使得T739小鼠肿瘤生长显著增快，认为TGFβ1对免疫系统有抑制作用，机制可能为通过破坏机体的免疫监视和免疫杀伤作用，或通过旁分泌作用刺激间质而间接促进肿瘤的生长。我们的结果支持前一种结论，转染SMMC7721细胞后c-myc，c-met，ras癌基因表达均下降，体现在转染后G418筛选上，正向转染的需49～50d阳性克隆才能铺满瓶底，而反向的则仅需31～43d，空载体为30～40d，说明TGFβ1对肝癌细胞生长有抑制作用，其详尽机制尚需进一步研究。
作者简介：封 岩,男,1961年12月生,博士,副研究员,现在海军医学研究所五室
作者单位 封 岩 高 峰 孔宪涛 第二军医大学长征医院临床免疫中心，上海,200003;
曹广文 张晓琴第二军医大学基础医学部微生物学教研室
参考文献
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4 Chen RH, Chang TY. Involvement of caspase family proteases in transforming gr owth factor beta induced apoptosis. Cell Growth Differ, 1997,8(7):821
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8 Cao GW, Kuriyama S, Du P, et al. Complete regression of established murin e hepatocellular carcinoma by in vivo tumor necrosis factor α gene transfe r. Gastroenterology, 1997, 112(2):501
9 曹广文，杜 平，杨文国，等. 携带HuIFN-β cDNA的重组逆转录病毒载体的构建及在 人肝癌细胞中的特异表达. 第二军医大学学报，1996，17(4)：301
10 杨和平,陆应麟,沈寒放,等. 转化生长因子β1正反义基因对人肺巨细 胞癌细胞体内外增殖的影响.中华肿瘤杂志,1997,19(2):89
11 高 平，陆应麟，葛学铭，等. TGFβ1质粒DNA直接瘤内注射对小鼠肿瘤生长 的影响，中华肿瘤杂志，1997，19(2)：93
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