急性白血病患者WT1基因与LRP基因关系的研究

临床血液学杂志 2000年第4期第13卷 实验研究

作者：郭晓楠　任金海　徐世荣　董作仁　林凤茹　王福旭　张学军　杜行严　姚尔固

单位：郭晓楠（河北医科大学第二医院血液科石家庄，050000）；任金海（河北医科大学第二医院血液科石家庄，050000）；徐世荣（河北医科大学第二医院血液科石家庄，050000）；董作仁（河北医科大学第二医院血液科石家庄，050000）

关键词：白血病；急性；癌基因；肾母细胞瘤；肺耐药相关蛋白；药物耐受性　预后

　　摘要　目的：探讨急性白血病患者WT1基因与LRP基因表达的关系。方法：应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测73例急性白血病患者及23例正常人的WT1及LRP基因的表达。结果：73例急性白血病患者中41例WT1基因表达阳性，25例LRP基因表达阳性；23例正常人中WT1基因表达均阴性，仅1例LRP基因表达阳性。WT1基因表达阳性患者的完全缓解（CR）率低于表达阴性者（分别为53.7%和84.4%，P＜0.01）；LRP基因表达阳性患者的CR率亦低于表达阴性者（分别为52.0%和75.0%，P＜0.05）。WT1表达阳性患者的LRP阳性率高于WT1表达阴性者（分别为46.3%和18.8%，P＜0.05）。结论：WT1基因的表达和(或)LRP基因的表达与急性白血病患者的化疗效果及预后密切相关，是影响急性白血病患者CR率的重要危险因素，且二者有一定的相关性。

The relationship between WT1 gene and LRP gene and

　　their prognostic value in acute leukemia

GUO Xiao-nan　REN Jin-hai　XU Shi-rong　DONG Zuo-ren　LIN Feng-ru

　　WANG Fu-xu　ZANG Xue-jun　DU Xing-yan　YAO Er-gu

　　(Department of Hematology, The Second Hospital, Hebei

　　Medical University, Shijiazhuang 050000)

　　Abstract　Objective:To evaluate the relationship between WT1 and LRP genes expression and their prognostic value in acute leukemia.Methods:Expressions of WT1 and LRP genes were measured in 73 patients with acute leukemia and 23 normal controls by RT-PCR method.Results:Expression of WT1 gene was found in 41 of 73 acute leukemia patients and none of 23 normal controls. Expression of LRP gene was found in 25 of 73 acute leukemia patients and 1 of 23 normal controls. Complete remission rate (53.7%) was lower in WT1 positive patients than in those (84.4%,P＜0.01) WT1 negative patients. Complete remission rate (52.0%) was also lower in LRP positive patients than in those (75.0%, P＜0.05) LRP negative patients. The rate of LRP expression was higher in patients with WT1 expression (46.3%) than in those without WT1 expression (18.8%,P＜0.05).Conclusion:The expression of WT1 and/or LRP gene can predict the treatment outcome and prognosis in acute leukemia patients. Expressions of WT1 and LRP are important risk factors affecting CR rate of acute leukemia patients.

　　Key words　Leukemia,acute　Onco genes　Wilms′ tumor　Lung resistance associated protein　Drug tolerance　Prognosis

　　WT1基因是从肾母细胞瘤（Wilms瘤）细胞的染色体11p13位点分离出来的肿瘤基因^〔1〕，近年来许多学者研究了WT1基因及多药耐药基因在急性白血病中的表达，探讨了WT1基因与预后、微小残留病、细胞凋亡等的关系。然而，关于WT1基因与急性白血病多药耐药基因相互关系，尤其是与肺耐药相关蛋白（LRP）关系的研究报道甚少，本文对此进行探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　研究对象

　　符合FAB协作组诊断标准的急性白血病患者73例，其中男42例、女31例，年龄14～67(35.25±13.84)岁。急性粒细胞白血病（AML）63例，其中M₁ 3例、M₂ 10例、M₃ 21例、M₄ 12例、M₅ 12例、M₆ 2例、MDS-AML 3例；急性淋巴细胞白血病（ALL）10例 ，其中L₁ 2例、L₂ 6例、L₃ 2例。所有患者均为初治者。以15名健康志愿者外周血及8名非血液病患者的骨髓作为正常对照，其中男15例、女8例，年龄(34.57±6.83)岁。所有患者的骨髓及对照者的外周血或骨髓标本均进行了WT1基因及LRP基因的检测，并以β-actin作为内对照。

　　1.2　单个核细胞（MNC）的分离及总RNA的提取

　　取静脉血5～8 ml或骨髓2 ml，肝素抗凝（100 U/ml），用生理盐水稀释3～4倍，然后将其缓慢加至4 ml的Ficoll淋巴细胞分离液中（相对密度1.077），以2000 r/min离心16 min，取界面层MNC，用生理盐水洗涤3次，-80 ℃保存备用或直接提取RNA，采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取细胞总RNA，-80 ℃保存。

　　1.3　cDNA合成及PCR扩增

　　引物由美国Cybersyn公司合成。其中WT1上游引物为 5′-CCCTGACCCTTCCCTTCT-3′， 下游引物为 5′-CCCGATGCCTTGCTCTCTGAT-3′，扩增产物的长度为182 bp^〔1〕；LRP上游引物为 5′-AGTCAGAAGCCGAGAAAG-3′，下游引物为 5′-CCCAGCCACAGCAAGGT-3′，扩增产物的长度为340 bp^〔2〕；以β-actin作为内对照，其中上游引物为 5′-CCCTTCCCTCCTCAGA-3′，下游引物为 5′-TGTCACCTTCACCGTTCCAG-3′，扩增产物的长度为325 bp^〔3〕；扩增条件：94 ℃变性40 s，WT1 55 ℃退火40 s、其余60 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，在PCR扩增仪（美国PE公司）上扩增30个循环，取10 μl扩增产物，在20 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳（75 V,50 min），EB染色，紫外透射仪下观察结果并照相。所用试剂均由Promega公司生产。

　　1.4　临床治疗方案

　　ALL采用VCDP（长春新碱、环磷酰胺、柔红霉素、泼尼松）方案进行诱导缓解；AML：M₃采用全反式维甲酸（ATRA）或以ATRA为主联用小剂量DA（柔红霉素、阿糖胞苷）或HA（三尖杉酯碱、阿糖胞苷）方案进行诱导缓解；其它亚型均采用DA 或DAE（E为足叶乙甙）方案进行诱导缓解。

　　1.5　统计学处理

　　采用SPSS 6.2统计软件，进行t检验、χ²检验及Logistic回归分析。

　　2　结果

　　2.1　正常人和急性白血病患者WT1基因及LRP基因的表达

　　73例急性白血病患者中41例（56.2%）WT1基因表达阳性，25例（34.3%）LRP基因表达阳性。23名正常对照者外周血或骨髓细胞中均未检测到WT1基因的表达，仅1例LRP基因表达阳性，见图1。

图1　WT1和LRP基因扩增电泳图

　　M. 分子标志，1、2 WT₁ mRNA(182 bp)，3、4 WT1阴性，

　　5 β-actin mRNA(325 bp)，6、7 LRP阴性，8 LRP mRNA(340 bp)

　　2.2　WT1及LRP基因的表达和预后的关系

　　41例WT1阳性表达患者CR 22例，CR率为53.7%，32例阴性患者CR 27例，CR率84.4%，两组差异有显著性意义（P＜0.01）。25例LRP阳性表达患者CR 13例，CR率52.0%，48例阴性患者CR 36例，CR率75.0%，两组差异有显著性意义（P＜0.05）。对性别、年龄、FAB分型、外周血白细胞计数、LRP及WT1进行的Logistic回归分析表明，WT1是影响CR率的重要危险因素，WT1基因阳性表达患者未缓解（NR）的相对危险度是阴性表达患者的7.55倍。

　　2.3　WT1基因和LRP基因的关系

　　73例急性白血病患者同时检测了WT1及LRP基因表达，41例WT1阳性表达者中19例LRP表达阳性，32例WT1阴性表达者中6例LRP阳性。WT1表达阳性患者的LRP阳性表达率明显高于WT1阴性表达的患者（分别为46.3%和18.8%,P＜0.05）。相关分析表明，WT1阳性表达与LRP阳性表达的Pearson相关系数为0.289（P＜0.05）。

　　3　讨论

　　近年国内外学者研究发现WT1基因在急性白血病细胞中高度表达，并与白血病的发生、发展及转归有一定的关系。本研究结果与文献报道^〔4～6〕一致，说明WT1基因在未成熟的白血病细胞中呈高表达，随细胞的分化成熟逐渐降低，而趋于成熟的正常造血细胞很少表达或不表达。我们发现，WT1阳性表达患者的CR率（53.7%）明显低于阴性表达患者（84.4%,P=0.005）；Logistic回归分析表明，WT1是影响CR率的重要危险因素，WT1基因阳性表达患者NR的相对危险度是阴性表达患者的7.55倍。这表明WT1表达情况可预测急性白血病患者的转归，此与Inoue及Bergmann等^〔5，7〕的研究结果相似。

　　肺耐药相关蛋白（LRP）是1993年发现的又一与多药耐药（MDR）有关的蛋白质^〔8〕，其可能主要通过核靶点屏蔽机制引起MDR。本研究发现，LRP阳性表达患者（表达率为34.2%）的CR率明显低于阴性表达患者，与文献报道^〔9～11〕的结果一致。证实了LRP在急性白血病患者中的过度表达与预后密切相关，并可能是初治急性白血病患者原发耐药的原因之一。

　　关于WT1基因与MDR的关系，目前报道尚不多见，Hirose等^〔12〕应用RT-PCR方法检测人类耐长春新碱的白血病细胞系中WT1、mdr₁、MRP（多药耐药相关蛋白）及p53等基因的表达，发现WT1可上调mdr₁的过度表达，可诱导mdr1的产生，因而可对抗化疗药物引起细胞凋亡，发生耐药。我们曾报道WT1表达和MRP有一定的关系^〔13〕。本研究亦发现，WT1阳性患者LRP阳性率较高，二者的表达有一定程度的关联，提示WT1阳性患者CR率低、预后差，可能有耐药机制参与。但WT1基因与LRP之间如何调控尚不清楚。

　　综上所述，WT1基因和(或)LRP基因在急性白血病患者中的过度表达和其预后密切相关，是影响急性白血病患者CR率的重要危险因素，且二者有一定的相关性。

　　河北省科委科研基金资助项目(No.98276190D)

　　林凤茹（河北医科大学第二医院血液科石家庄，050000）

　　王福旭（河北医科大学第二医院血液科石家庄，050000）

　　张学军（河北医科大学第二医院血液科石家庄，050000）

　　杜行严（河北医科大学第二医院血液科石家庄，050000）

　　姚尔固（河北医科大学第二医院血液科石家庄，050000）

　　参考文献

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　　［4］Miwa H, Beran M, Saunders G F, et al. Expression of the Wilms' tumor gene(WT1) in human leukemias. Leukemia, 1992, 6:405～409

　　［5］Inoue K, Sugiyama H, Ogawa H, et al. WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood, 1994, 84:3071～3079

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　　［7］Bergmann L, Miething C, Maurer U, et al. High levels of Wilms' tumor gene (WT1) mRNA in acute myeloid leukemias are associated with a worse long-term outcome. Blood, 1997,90:1217～1225

　　［8］Scheper R J, Broxterman H J, Scheffer G L, et al. Overexpression of a M(r) 110,000 vesicular protein in non-P-glycoprotein-mediated multidrug resistance. Cancer Res, 1993, 53:1475～1479

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　　［12］Hirose M,Kuroda Y. p53 may mediate the mdr-1 expression via the WT1 gene in human vincristine-resistant leukemia/lymphoma cell lines. Cancer Lett, 1998, 129: 165～171

　　［13］郭晓楠，徐世荣，董作仁，等. 白血病患者WT1基因的表达及与预后及多药耐药的关系.中华血液学杂志，1999，20：69～72

(收稿 1999-09-02　修回 1999-12-2)