β₂受体激动剂影响哮喘豚鼠糖皮质激素受体功能的研究

江苏医药 2000年第9期第26卷 实验研究

作者：戴山林　黄茂　王虹　杨玉　邹洪波　郑仕中　周大虎

单位：戴山林 黄茂 王虹 杨玉（210029　南京医科大学第一附属医院呼吸科）；邹洪波 郑仕中 周大虎（南京医科大学基础同位素研究室）

关键词：哮喘；受体激动剂，β；糖皮质激素

　　【摘要】　目的　探索β₂受体激动剂（β₂AA）对哮喘豚鼠血淋巴细胞糖皮质激素受体（GR）功能的影响。方法　50只哮喘豚鼠，随机分为对照组（10只），沙丁胺醇组（10只），地塞米松组（10只），地塞米松加沙丁胺醇组（20只）。采用放射性配基结合分析法测定哮喘豚鼠血淋巴细胞GR的亲和力（kd）及受体最大结合容量（Bmax），用凝胶阻滞分析法测定GR与糖皮质类固醇反应片段（GRE）的结合能力。结果　沙丁胺醇组GR与GRE结合值与对照组比较有显著差异（P＜0.01），地塞米松组GR与GRE结合值与对照组比较有显著差异（P＜0.01），沙丁胺醇加地塞米松组（7天，14天）GR与GRE结合值与对照组比较有显著差异（P＜0.01），且逐渐下降，具有时间依赖性。结论　β₂AA可降低GR与GRE的结合能力，削弱糖皮质激素的作用，长期应用β₂AA治疗哮喘是不恰当的。

Experiment studies on the effects of β₂-adrenoceptor

　　in asthmatic guinea pigs

　DAI Shanlin，HUANG Mao，WANG Hong，et al

　　（Department of Respiratory Diseases，First Affiliated Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing 210029）

　　【Abstract】　Objective　To study the effects of β₂-adrenoceptor agonists（β₂AA） on the functions of glucocorticoid receptor（GR） in blood lymphocytes of asthmatic guinea pigs．Methods　Measuring Kd （affinity） and Bmax（maximum binding capacity） of GR by radioligand binding assay of receptors（RBA） and the binding of glucocorticoid receptors（GR） and glucocorticoid response elements（GRE） by electrophoretic mobility shift assay（EMSA） in blood lymphocytes of asthmatic guinea pigs．Results　The band density of GR and GRE binding in the salbutamol group was lower than that in the control（P＜0.01），and the band density of GR and GRE binding in the dexamethasone was higher than that in control（P＜0.01）；The band density of GR and GRE binding in the salbutamol＋dexamethasone groups（7 days，14 days） was respectively lower than that in the control and decreased gradually in a time-dependent manner．Conclusion　β₂AA might decrease the ability of GR and GRE binding and inhibit the anti-inflammatory effects of glucocorticoids．Long-term use of β₂AA to control asthma is not advisable．

　　【Key words】　　Asthma　Adrenoceptor agonist，β　Glucocorticoid

　　支气管哮喘（哮喘）是一种慢性气道炎症性疾病。糖皮质激素（glucocorticoid，GC）具有强力的抗炎作用，已成为治疗哮喘的第一线药物。β₂受体激动剂（β₂-adrenoreceptor agonist，β₂AA）是最有效的支气管扩张剂，现仍普遍应用于哮喘病的治疗。临床上这两种药物常被联合使用。近年来，有人认为规则使用β₂AA可使哮喘病情恶化和增加病死率^［1］。我们的研究旨在从分子水平探索β₂AA沙丁胺醇对哮喘豚鼠血淋巴细胞糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）功能的影响，为临床合理应用β₂AA和GC提供重要的实验依据。

　　材料与方法

　　一、实验材料

　　6，7-³H（N）地塞米松（35.0 Ci／mmol，美国杜邦公司），腺苷5′-（γ-³²P）三磷酸盐（5000　Ci／mmol，北京亚辉），T₄多核苷酸激酶（promega），Beckman J2-21高速离心机，RKB液闪计数仪（pharmacia公司），光密度扫描仪（美国UVP公司）。

　　二、哮喘动物模型的复制及分组

　　50只豚鼠（江苏省实验动物中心提供），雄性，体重450～550g，参照国内外常用的方法复制哮喘模型^［2］。初次诱喘后，隔日诱喘，连续5次。哮喘豚鼠随机分为A组（对照组，10只）；B组（沙丁胺醇组，10只），每次予沙丁胺醇0.2mg／kg，肌肉注射，一日3次，连续14天；C组（地塞米松组，10只），每次予地塞米松0.5mg／kg，肌肉注射，一日3次，连续14天；D组（沙丁胺醇＋地塞米松组，20只)，每次同时予沙丁胺醇0.2mg／kg，一日3次，及地塞米松0.5mg／kg，一日2次，肌肉注射。其中随机分为D1组（10只，用药3天），D2组（5只，用药7天），D3组（5只，用药14天）。

　　三、哮喘豚鼠血淋巴细胞的制备

　　将哮喘豚鼠用25％乌拉坦（1.2g／kg）腹腔内注射麻醉后，颈动脉插管放血，抗凝。用pH 7.2PBS液将抗凝血稀释1倍。加Ficoll-泛影葡胺淋巴细胞分离液（比重1.085kg／L），离心后收集淋巴细胞层。

　　四、用放射性配基结合分析法测定哮喘豚鼠血淋巴细胞GR的Kd（亲和力）及Bmax（最大受体结合容量）值

　　用pH7.2Hank′s液将淋巴细胞调成1.5×10⁶个细胞／毫升的浓度，取1ml悬液加入³H地塞米松，相应浓度为2nmol、4nmol、8nmol、12nmol、20nmol，并设平行管及非特异性结合管。经处理后行液闪计数，计数效率35％。采用Scatchard标准作图法计算出Bmax及Kd值。

　　五、采用凝胶阻滞分析法（EMSA）检测GR与GRE（糖皮质类固醇反应片段）结合能力

　　1.核蛋白提取

　　取3×10⁶个淋巴细胞，参照Dignam^［3］标准方法提取淋巴细胞核蛋白，用考马斯亮兰法测定核蛋白的浓度。

　　2.寡核苷酸探针的标记与纯化

　　将经过提纯的包含特异性GRE的dsDNA（双链DNA），序列为5′CCATATGCAGCCACTGTTCTTAG-

　　CGGGTTT3′（上海生工生物工程公司）^［4］，参照Peters^［5］方法，用［γ-³²P］ATP标记该dsDNA探针，用自制SG-25Spin层析柱纯化探针，并用液闪计数仪测定其比活度达1×10⁴cpm／50ps dsDNA。

　　3．EMSA

　　参照Peters^［5］法行EMSA，用光密度扫描仪读取特异性漂移条带的密度，以相关密度单位（RDU）表示。

　　六、统计学处理

　　数据以±s表示，采用t检验处理数据。

　　结果

　　各组哮喘豚鼠血淋巴细胞GR的Kd、Bmax及GR与GRE结合条带密度见表1。

表1　各组哮喘豚鼠血淋巴细胞GR的Kd、Bmax　及GR与GRE结合条带密度（±s）

　　注：与A组比较，^*P＞0.05；与A组比较，^**P＜0.01。

　　A组：对照组；　B组：沙丁胺醇组；　C组：地塞米松组；　D1组：沙丁胺醇＋地塞米松，3天组；　D2组：沙丁胺醇＋地塞米松，7天组；　D3组：沙丁胺醇＋地塞米松，14天组。

　　结果表明各组GR的Kd值无明显差异（P＞0.05）；对照组与沙丁胺醇组GR的Bmax无明显差异（P＞0.05）；地塞米松组及沙丁胺醇＋地塞米松组GR的Bmax较对照组与沙丁胺醇组明显增高（P＜0.01）。结果表明沙丁胺醇组淋巴细胞GR与GRE结合条带密度值明显低于对照组（P＜0.01），地塞米松组明显高于对照组（P＜0.01）；沙丁胺醇＋地塞米松组（7天组及14天组）淋巴细胞GR与GRE结合条带密度值均低于对照组（P＜0.01），且具有时间依赖性。

　　讨论

　　近年来的研究表明淋巴细胞在哮喘中起着重要作用，淋巴细胞（特别是T淋巴细胞）表达高密度的β₂受体及GR^［6］。β₂受体激动剂和GC各自通过其受体发挥生物学作用。目前大量的研究证明规律使用β₂AA的哮喘患者肺功能并无改善，甚至病情恶化，哮喘控制失败。本研究结果表明使用β₂AA对淋巴细胞GR的Kd及Bmax没有影响，但沙丁胺醇组GR与GRE的结合值约为对照组的17％，严重影响GR与GRE的结合，对GR与GRE的亲和力没有影响^［7］。目前认为β₂AA致GR与GRE下降的机制是其与受体结合后激活细胞膜内侧腺苷酸环化酶（AC），使cAMP含量增加，继而激活cAMP依赖的蛋白激酶A（PKA）发挥作用，激活cAMP应答成分结合蛋白（CREB）并形成CREB-GR复合物，减少GR与GRE的结合，抑制内、外源性GC的抗炎作用。Adcock等^［8］报道β₂受体激动剂使cAMP含量增加，活化CREB，继使AP-1（活化蛋白-1）或NF-κB（核因子-κB）激活，后者与GR结合形成复合物，导致GR有效数量进一步减少，GC效应减弱。

　　本研究结果显示当沙丁胺醇与地塞米松合用3天时，可使GR-GRE结合值较对照组下降，7天时明显下降，14天时仅为对照组的25％，但高于沙丁胺醇组，远低于地塞米松组。该结果进一步揭示β₂AA对GR-GRE结合数量的影响，即同时合用地塞米松时，GR-GRE的结合值仍然是低下的，且随着时间的延长，GR-GRE的结合值越低，具有时间依赖性。临床研究发现，GC治疗3周将阻断气道对吸入抗原的反应，如联合吸入相对大剂量的β₂AA，则丧失GC对气道的保护作用，减少β₂AA吸入量可恢复气道对GC的反应^［9］。对一组GC严重依赖的哮喘患者研究亦发现，逐渐撤除β₂AA的吸入可减少口服强的松的需要量^［10］。因此长期使用β₂AA控制哮喘是不恰当的，甚至是有害的。

　　综上所述，虽然β₂受体激动剂仍然是一类较强的支气管扩张剂，但长期大剂量使用β₂受体激动剂是不宜提倡的。对哮喘患者，尤其是慢性哮喘患者，应以GC有效控制炎症反应为主，必要时可短期予以小量β₂受体激动剂 。

参考文献

　　1，Suissa SP，Ernst JF，Boivan RI，et al．A cohort analysis of excess mortality in asthma and the use of inhaled beta-agonists．Am Rev Respir Dis，1994，149：604-610．

　　2，刘朝晖，徐军，钟南山．内皮素与肿瘤坏死因子在哮喘发病中的作用．中华结核和呼吸杂志，1995，18：366-368．

　　3，Dignam JD，Lebovitz RM，Roceder RG．Accurate transcription initiation by RNA polymerase Ⅱ in a soluble from isolated mammalian nuclei．Nucleic Acids Res，1983，11：1475-1489．

　　4，Komatsu K，Oeda T，Strott CA．Cloning and sequence analysis of the 5′-flanking region of the estrogen sulfotransferase gene：steroid response elements and cellspecific nuclear DNA-binding proteins．Biochem Biophys Res Commun，1993，194：1297-1304．

　　5，Peters MJ，Adcock IM，Brown CR．β-Adrenoceptor agonists interfere with glucocorticoid receptor DNA binding in rat lung．European Journal of Pharmacology，1995，289：275-281．

　　6，Barnes PJ．Beta-adrenergic receptors and their regulation．Am J Respir Crit Care Med，1995，152：838-860．

　　7，Adcock IM，Lane SJ，Brown CR，et al．Differences in binding of glucocorticoid receptor to DNA in steroid-resistant asthma．J Immunol，1995，154：3500-3505．

　　8，Adcock IM，Stevens DA，Barnes PJ．Interactions of glucocorticoids and β₂-agonists．Eur Respir J，1996，9：160-168．

　　9，Wong CS，Wahednal I，Pavord ID，et al．Effects of regular terbutaline and budesonide on bronchial reactivity to allergen challenge．Am J Respir Crit Care Med，1994，150：1268-1278．

　　10，Barnes PJ，Adcock IM．Anti-inflammatory actions of steroids：molecular mechanisms．Trends Pharmacol Sci，1993，14：436-441．

收稿：1999-11-30　修回：2000-03-27