国人血清对氧磷酶192 Gln/Arg多态性及其活性与冠心病发病的关系

临床心血管病杂志 2000年第4期第16卷 临床研究

作者：刘康桐　曾高峰　刘革修　王燕　丁翠芬

单位：刘康桐　曾高峰　刘革修　王燕　丁翠芬（衡阳医学院第二附属医院内科 湖南衡阳，421001）；刘革修（衡阳医学院药理教研室）

关键词：对氧磷酶；多态现象(遗传学)；冠状动脉疾病

　　摘要　目的：研究中国人对氧磷酶(PONA)192 Gln/Arg遗传多态性及其活性与冠心病(CHD)发病的关系。方法：RFLP-PCR法和醋酸苯酯法，检测256例CHD患者和155例相匹配的正常人的PONA 192 Gln/Arg基因型及其活性。同时测定血脂、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)。结果：155例正常人中AA基因型占22%，BB基因型占32.1%，AB基因型占46%。256例CHD患者中含B等位基因的频率明显高于正常对照组(64%∶55%，P＜0.05)，且CHD患者PONA活性低于正常人(105±66∶131±79，P＜0.05)。PONA活性与MDA水平密切相关(P＜0.01)。结论：PONA与CHD发病相关，且可能通过抑制脂蛋白脂质氧化而阻止动脉粥样硬化形成。

The relation of serum paraoxonase activity and Gln-Arg 192 polymorphism with coronary heart disease

LIU Kang-tong　ZENG Gao-feng　WANG Yan　DING Cui-fen

　　(Department of Internal Medicine,The Second Affiliate Hospital

　　of Hengyang Medical College,Hengyang 421001)

　　LIU Ge-xiu

　　(Department of Pharmacology, Hengyang Medical College)

　　Abstract　Objective:To study Gln-Arg 192 polymorphism of paraoxonase (PONA) in Chinese and serum PONA activity in coronary heart disease (CHD).Method:PONA enzyme activity was measured with phenylacetate as substrate,genotype was determined using PCR and restriction mapping with Alw l.in 256 cases with CHD and 155 normal controls. Plasma lipid,malodiadehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) were assayed according to kit manu.Result:The genotype distribution of the PONA polymorphism was comparable between CHD patients and control subjects,CHD patients had a significantly higher frequency of the B allogene (64% vs 55%,P＜0.05) and lower frequency of the AA genotype (36% vs 45%,P＜0.05).PONA activity was lower in CHD then normal control (105±66∶131±79，P＜0.05) PONA activity in CHD patients was closely related with serum level of MDA (P＜0.01).Conclusion:PONA was releted with the pathogenesis of CHD,decrease of its activity might cause lipids oxidizing.

　　Key words　Paraoxonase　Polymorphism (genetics)　Coronary disease

　　对氧磷酶(PONA)是一种钙依赖性糖蛋白，分子量为43 ku，属酯水解酶。人血清PONA存在于HDL上，在人群中表现为底物依赖性多态性分布，由第7号染色体上的一对等位基因控制。国外研究表明PONA与冠心病(CHD)发病有关^〔1～4〕，但也有研究表明PONA与CHD发病无关^〔5，6〕，其原因可能是种族差异。我们分析了256例中国CHD患者和155例相匹配的正常人的PONA 192 Gln/Arg基因型及其活性、血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平。现报告如下。

　　1　资料与方法

　　1.1　标本收集

　　CHD组256例，为临床确诊患者，无亲缘关系，其中心绞痛187例，男133例，女54例，年龄(60±0.8)岁；心肌梗死89例；男67例，女22例，年龄(63±0.8)岁。对照组155例，无CHD、糖尿病和严重感染病史者，男107例，女48例，年龄(47±0.6)岁。当天晚上禁食，根据测定目的不同，次日清晨静脉采血。用于测PONA192 Gln/Arg基因型的静脉血用柠檬酸抗凝，不加抗凝剂的静脉血的血清用于PONA活性测定。血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)从临床病例中收集。

　　1.2　方法

　　1.2.1　MDA和SOD测定：MDA和SOD测定采用试剂盒(南京城建生物工程公司)，操作见说明书。计算公式如下：MDA(μmol/L)=

　　1.2.2　PONA活性测定：参照文献［1，7］，采用醋酸苯酯法。PONA=A×68 793(u/L)

　　1.2.3　PONA 192 Gln/Arg基因型分析：DNA提取参照文献［8］。PCR扩增包括编码PONA 192的基因，上游引物为5′ TATTGTTGCTGTGGGACCT-

　　GAG 3′和下游引物5′ CACGCTAAACCCAAATA-

　　CATCTC 3′。反应条件：总体积为50 μl，15 mmol/L氯化镁5 μl，DNA模板100 ng，50 pmol上下游引物，10 mmol/L各种dNTP 1 μl，2 u Taq DNA聚合酶。循环参数：94℃ 1 min，61℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环。PCR产物用限制性内切酶Alw 1酶切消化，10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色。由于A等位基因192位编码Gln，其PCR产物不能被Alw 1酶切，B等位基因192位编码Arg，其PCR产物可以被Alw 1酶切。所以，纯合子AA基因型：电泳产生1条带，99 bp，纯合子BB基因型：2条带，65 bp和34 bp，杂合子AB基因型：3条带,99 bp、65 bp和34 bp。

　　1.3　统计学处理

　　基因型分布用频率表示，采用χ²检验。其他数据均以±s表示，组间比较用t检验。

　　2　结果

　　CHD组与对照组BMI、血脂、PONA活性及MDA水平比较见表1。两组PONA活性与SOD活性无相关性(未列)。

　　CHD组与对照组PONA基因型及等位基因频率比较见表2。

表1　CHD与对照组BMI、血脂、PONA活性、MDA水平比较　　±s

　　与对照组比较¹⁾P＜0.05，²⁾P＜0.01

表2　CHD组与对照组PONA基因型及等位基因频率

　　与对照组比较¹⁾P＜0.05

　　3　讨论

　　CHD发生发展过程复杂，影响因素较多，主要包括影响脂质代谢和血管功能的因素。许多证据表明纯化的PONA具有抗LDL氧化修饰作用。从而推测PONA通过此功能参与动脉粥样硬化(AS)病理生理过程。活性PONA可能通过消除OxLDL而抑制动脉粥样硬化形成作用^〔9〕。越来越多的证据表明PONA是心血管疾病的独立危险因素。PONA 192位具有AA、AB、BB三种不同表型。PONA活性主要由192位影响，而55位影响极少。不同种族其表型分布不一样。且与CHD和AS发生关系不同。在美国人和法国人中两者具有密切相关性，而在芬兰人中两者无相关性。我们研究其目的是了解中国人PONA 192位多态性及其与CHD的关系。结果中国人PONA 192位多态位点分布为：AA 22.0%、BB 32.1%及AB 45.9%，且与血脂水平无明显关系，这可能因为其不参与脂质代谢。虽然其参与脂质修饰，但是体内修饰脂质只是相当少部分，仅在局部相对含量增高，如AS斑块。在正常人群中，AA、AB和BB各等位基因人群PONA活力无显著差别；但CHD组PONA活性明显低于对照组(P＜0.05)；CHD组B等位基因频率显著高于对照组(P＜0.05)。此结果说明在中国人群中PONA 192-B与CHD发生关系密切。我们的统计分析结果还显示PONA活性与MDA水平具有相关性(表1)，这可能与其水解氧化脂质有关。OxLDL能被巨噬细胞吞噬形成泡沫细胞，从而导致AS的形成。纯化的人血清PONA能显著降低脂质过氧化物在动脉管壁的积累^〔10〕。这可能是PONA可预防AS形成的机制。又CHD组PONA活性显著低于对照组，由此说明PONA与CHD具有密切相关性。虽然PONA 192-B活性较低，但PONA多肽性与其血清PONA活性无显著性，这可能由于血清还存在其他影响PONA活性因素。目前PONA与CHD的确切关系或机制尚未完全阐明，有待进一步研究。

(编辑 邱诰文)

　　湖南省卫生厅资助课题

　　参考文献

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(收稿 1999-03-27　修回 1999-11-24)