内源性睡眠诱导物质油酰胺的研究进展

中国药物化学杂志 2000年第4期第10卷 综　述

作者：郭长彬　宋宏锐

单位：沈阳药科大学基础部有机化学教研室，沈阳 110015

关键词：油酰胺；睡眠；5-羟色胺受体；缝隙连接；大麻受体；构效关系；生合成；酰胺水解酶

　　摘　要　油酰胺是近几年来发现的内源性睡眠诱导物质，具有多种生理活性，是新型生物信号分子——长链脂肪酸酰胺家族的代表.本文对其发现、生理作用、构效关系、睡眠诱导的作用机制、体内分布、生物合成、酰胺水解酶及其抑制剂进行了综述.

The Development of Oleamide-an Endogenous Sleep-inducing Lipid

Guo Changbin，Song Hongrui

　　(Department of Basic Courses,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)

　　Abstract　Oleamide is an endogenous fatty acid primary amide that accumulates in the cerebrospinal fluid under sleep deprivation and induces physiological sleep in animals.This paper reviewed its discovery,physiological activities,structure-activity relationship(SAR),mechanisms of sleep-inducing,distribution,biosynthesis,inactivation in animal tissues and fatty acid amide hydrolase(FAAH).

　　Key words　oleamide;sleep;5-hydroxytryptamine receptor;gap junction;cannabinoid receptor;structure-activity relationship;biosynthesis;amide hydrolase

　　20世纪90年代以来，随着两个天然存在于哺乳动物大脑的长链脂肪酸酰胺——油酰胺(cis-9-octadecenamide,oleamide,ODA)和花生四烯酰乙醇胺（arachidonoylethanolamide,anandamide,AEA）的发现和其生理活性的初步揭示，围绕这两个内源性生理活性物质展开的生化、生理、药理、药化等方面的研究已成为一个科研热点，美、英、日、意、以色列、俄、中国等国的一些科研机构相继开展了该项研究.ODA最初从被剥夺睡眠的猫的脑脊液中分离鉴定，被证明可诱导大鼠产生生理性睡眠^〔1〕；AEA最初从猪大脑分离鉴定，被证明是中枢大麻CB₁受体的内源性配体^〔2〕，两者都具有多种生理活性.ODA和AEA同是脂肪酸酰胺水解酶的底物，因降解速度不同，两者产生了相互作用的关系^〔3〕.本文综述了ODA的发现、生理作用、结构与活性关系、体内分布、代谢途径等有关方面.

　　1　油酰胺的发现、生理作用及其结构与活性的关系

　　寻找内源性诱导睡眠物质一直是很多科研机构的研究热点，有几种物质，包括Δ-睡眠诱导肽和前列腺素PGD₂，曾被认为具有睡眠诱导作用，但其生理作用的分子机制大部分还不清楚.Cravatt等人最先从被剥夺睡眠的猫的脑脊液中分离并鉴定了油酰胺，发现其具有睡眠诱导作用^〔1〕.该小组后来又用化学合成方法对分离出的痕量油酰胺进行了结构确认^〔4〕.

　　1.1　镇静和催眠作用

　　用合成的油酰胺给大鼠腹腔注射，剂量等于或超过5 mg/只时，明显对自发行为产生抑制，出现运动减少，闭眼和正常睡眠样的镇静行为，象正常睡眠一样，此时，大鼠对声音刺激源保持着方位反应，并对刺激源保持注意，镇静行为的潜伏期是4 min，作用持续时间呈剂量依赖型，且具有饱和性（给药20 mg/只和50 mg/只作用时间均为2.5 h）^〔1〕.Yang等人报道，对小鼠腹腔注射油酰胺，对其运动活性产生呈时间相关性的抑制，给药30 min后呈现出最大作用，240 min后恢复正常，且在43.7～700 mg/kg剂量范围呈剂量依赖性.小鼠实验，油酰胺可加强地西泮的抑制作用，并拮抗乙醇、去氧麻黄碱和咖啡因的兴奋作用^〔5〕.

　　经检测油酰胺在脑中含量与睡眠清醒周期密切相关，缺乏睡眠时浓度增加，恢复睡眠时浓度减小,但是目前对其调节通路还不清楚.油酰胺对大鼠腹腔注射超过5 mg/只，或脑腔注射2.8 μg/只，均可诱导产生生理性睡眠，证明油酰胺可直接作用于脑.与给药时用的溶剂和油酸相比，油酰胺可增加总的慢波睡眠时间和个体平均慢波睡眠时间^〔1〕.油酰胺可显著增加给予域下催眠剂量戊巴比妥钠的小鼠的睡眠率，并缩短睡眠潜伏期，延长催眠剂量戊巴比妥钠引起的睡眠时间^〔5〕.

　　油酰胺的结构与镇静催眠活性研究表明：油酸无活性；其反式异构体有类似作用但较弱（大鼠给药10 mg/只，反式异构体作用时间1 h，油酰胺2 h）；双键移位至8位、11位及增长碳链至22个碳的三个化合物，镇静催眠活性的程度和持续时间均显著降低.这些结果均表明，油酰胺产生镇静催眠活性要求很高的结构专一性^〔1〕.

　　1.2　对5-羟色胺（5-HT）受体系统的调节作用

　　最近的研究表明油酰胺可调节5-羟色胺能神经传导，对5-HT受体各亚型有不同的药理作用^〔6～8〕.在分别表达了不同5-HT受体亚型的青蛙卵母细胞中，用微电极测量由5-HT与受体作用而引发的氯离子流，在ODA和5-HT均为100 nmol/L情况下，ODA对5-HT与5-HT_2C受体的反应产生365%的加强作用；对5-HT与5-HT_2A受体的反应产生260%的加强作用；对5-HT与离子门控通道5-HT₃受体的反应无影响^〔6〕.在自然表达有5-HT_2A受体的大鼠脑垂体P11细胞中，在ODA和5-HT均为100 nmol/L情况下，ODA对在5-HT作用下5-HT_2A受体引发的磷酸肌醇的水解产生228%的加强作用；在表达了5-HT₇受体的Hela细胞中，ODA对由该受体介导的cAMP水平的增加产生呈浓度依赖性的加强作用，但当有5-HT存在时，当两者浓度均为100 nmol/L时，ODA对5-HT与5-HT₇受体的反应产生50%的抑制作用^〔7〕，由此推测ODA可能作用于一个变构位点.在表达了大鼠5-HT_2A受体的NTH3T3细胞和表达了人5-HT_1A受体的RAT-1细胞中，受体激发产生的细胞增生作用可由测定β-半乳糖苷酶活性而确定，当ODA和5-HT均为100nmol/L时，ODA对5-HT与5-HT_1A受体的反应产生370%的加强作用；对5-HT与5-HT_2A受体的反应产生260%的加强作用^〔8〕.

　　油酰胺对5-HT受体2A和2C亚型调节的结构与活性关系是：1）9位顺式双键的存在、位置和立体构型是必须的，甚至微小的结构改变都会减弱或消除活性，其双键饱和物产生与之相反的拮抗作用.2）当其酰胺端被取代为仲或叔酰胺后还有部分活性，且小取代基取代更有利于保持活性.3）当其酰胺端换成酸、酯、醛、醇、胺、缩醛或亲电的酮后，均引起活性减弱或消失.4）对甲基端或者连接双键与酰胺的烃链的修饰可非常明显地消除活性.对于5-HT_1A受体酰胺端的结构修饰造成的活性减少较轻.总之，油酰胺及其结构类似物可对5-HT受体亚型产生选择性调节，甚至对不同亚型有相反的影响^〔6，8〕.

　　1.3　对大鼠神经胶质细胞间进行的缝隙连接介导的信号传输（GJMC）的抑制作用

　　缝隙连接是高等动物神经元间的一种信号传输方式，通过它可传递局部电流，并允许分子量小于1 000道尔顿的小分子被动扩散.ODA可强有力并有选择性地抑制在大鼠神经胶质细胞间进行的缝隙连接介导的信号传输，但是对在同样细胞中由机械刺激引起的Ga²⁺传递却没有影响，然而传统上GJMC抑制剂（如庚醇、18β-甘草亭酸等）不仅抑制GJMC而且抑制细胞间的Ga²⁺流.ODA通过抑制GJMC调节着大脑细胞间的信号联系，由此可能会影响到诸如睡眠等高级神经活动^〔9〕.

　　ODA抑制GJMC的结构与活性关系是：1）与花生四烯酰胺相比，油酰胺更有效.2）要求链长16～24个碳（16～18个碳最好）.3）羰基端应为酰胺键，做氢键受体而非供体.4）9位双键的顺式构型.5）疏水的甲基末端.在这些限制条件下，可做一些结构修饰，有的衍生物比ODA可有更好的体内活性^〔10〕.Guan等人报道：油酸和ODA的反式异构体，即使在大剂量时也无效；(Z)-11-十八碳烯酰胺、油酰乙醇胺和(Z)-8-十八碳烯酰胺有效但较弱^〔9〕.

　　1.4　ODA的大麻样作用

　　1964年发现了大麻的活性成分Δ⁹-四氢大麻酚，近几年来相继发现大麻CB₁和CB₂受体，CB₁受体存在于中枢和外周神经系统，CB₂受体主要存在于免疫细胞中，两者均与Gi/Go蛋白相耦联.AEA是大麻中枢CB₁受体的配体.大麻受体的生理作用涉及到运动活性抑制、细胞增生、止疼、炎症与免疫调节、食欲和呕吐控制等方面^〔11〕.ODA浓度直到10 μmol/L也不与大麻CB₁或CB₂受体直接结合，但是它表现出如下一些大麻样的作用：1)ODA可抑制抗CD₃细胞、ConA激活的初生淋巴细胞、T细胞和B细胞的增生，100 μmol/L时产生完全抑制，该活性具有立体选择性，反式异构体和其双键饱和物无活性.在抑制淋巴细胞增生上ODA和AEA是协同作用的.2)ODA可对人乳腺癌EFM-19细胞和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12细胞的增生和分化产生抑制作用，ODA抑制作用的IC₅₀值为11.3 μmol/L.CB₁受体拮抗剂SR14176(0.5 μmol/L)可拮抗ODA和AEA的作用，说明此作用可能由大麻CB₁受体所介导^〔12〕.3)在对小鼠大麻样运动行为的四个实验中，ODA有显著活性，但比AEA弱^〔3〕.这可能与它对AEA产生竞争性抑制有关.

　　2　关于ODA诱导睡眠的作用机制的几个假说

　　到目前为止，对ODA诱导睡眠的作用机制还没有定论，在实验基础上提出了以下几个假说：1）通过加强5-羟色胺对5-HT受体的作用而产生^〔6～8〕.2）通过抑制在神经胶质细胞间由缝隙连接介导的信号传输而产生^〔9,10〕.3）通过对GABA_A受体的变构调节而产生^〔12〕.4）通过类似与全麻药对细胞膜的扰动而产生^〔13〕.5）通过对大麻受体的作用而产生.ODA在50 μmol/L浓度下，可加强AEA与CB₁受体结合作用大约一个数量级^〔3〕，并且通过竞争性抑制AEA的水解来调节AEA的浓度，从而通过大麻受体而起作用.

　　3　ODA的体内分布和代谢途径

　　3.1　体内分布

　　对ODA在动物组织和细胞的含量分析研究报道较少.在小鼠成神经细胞瘤N18TG2细胞中，Di Marzo等报道的含量为1.5 μg/10⁹细胞^〔14〕,Bisogno等报道为1.55 μg/10⁹细胞，是AEA在同一细胞含量的80多倍^〔15〕.大鼠PC12嗜铬细胞和人乳腺癌EFM-19细胞含量分别是19.2 μg/10⁹和4.5 μg/10⁹细胞，人血浆含量1.7 μg/mL^〔14〕.人、牛和山羊的奶中含量为0.055～1.27 μg/mL^〔16〕.

　　3.2　生合成

　　尽管对ODA的组织分布和细胞起源知之甚少，为阐明其可能的生合成假说，推动对其作用的分子机制的研究，已做了一些研究工作，文献报导的有以下三种生合成路线假说：

　　路线一：油酰辅酶A和甘氨酸在肝脏经酰基辅酶A:甘氨酸N-酰基转移酶(ACGNAT)催化合成油酰甘氨酸，随后转运至血液经酞酰甘氨酸α-酰胺化酶（α-AE）催化氧化裂解成油酰胺.此路线是受含酰胺末端的酞类激素的生源学的启发而提出的（见图1）^〔17〕.

Fig.1　Suggested biosynthetic route 1 of ODA

　　路线二：Maurelli等人^〔18〕提出油酰胺是由降解它的脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase,FAAH）,反过来催化由油酸和氨合成油酰胺.其实验证据是在体外实验中用油酸、氨与大鼠的大脑匀浆一起温孵生成了ODA，并且实验证明微粒体部分酶催化活性最高，大脑匀浆被煮沸后不再有活性（见图2）.

Fig.2　Suggested biosynthetic route 2 of ODA

　　路线三：Bisogno等人^〔19〕同意体外过程按路线二进行，但提出在体内按图3的路线进行，其证据是在完整的小鼠成神经细胞瘤N18TG2细胞中，生成ODA的量仅与带有磷酸酯基的〔¹⁴C〕油酸直接相关，而同游离的〔¹⁴C〕油酸含量无关（见图3）.对于这三种路线还有待进一步实验验证和完善.

Fig.3　Suggested biosynthetic route 3 of ODA

　　3.3　DOA的体内失活途径和酰胺水解酶

　　传统神经递质的失活通常先由神经元或星状细胞易化摄取，随后被特定的酶所降解.ODA和AEA均通过被动扩散透过细胞膜进入细胞，还未发现其特定的转运蛋白^〔20〕.在细胞内，ODA经脂肪酸酰胺水解酶催化水解为无活性的油酸和氨^〔1〕，该酶催化活性最佳pH值范围是9～10^〔21〕.

　　有多种证据证明水解ODA和AEA的酶为同一个酶——FAAH,ODA和AEA的水解有一样的pH和温度依赖性，均可被烷化剂所抑制，花生四烯酰三氟甲基酮对其均产生竞争性抑制且有同样的IC₅₀值，两者均可被对方竞争性抑制.水解两者的酶有一样的色谱参数，加热后均失活.从小鼠N18TG2细胞得到的“AEA酰胺水解酶”和“ODA水解酶”有着同样的动力学性质，两酶在等电聚焦凝胶电泳实验中有同样的流动性质^〔18〕.这些结果说明ODA和AEA均为FAAH的底物.FAAH还可水解2-花生四烯酸甘油酯（另一个CB₁受体的内源性配体）和棕榈酰乙醇胺^〔12〕.由此可见，FAAH起着使体内活性长链脂肪酸酰胺和酯失活的共同工具的作用.

　　ODA和AEA两者相互竞争性地抑制对方的水解，且呈剂量依赖性，FAAH水解AEA速度比ODA快^〔3〕，体内ODA的含量比AEA多^〔14〕.这一事实为解释这两类生物活性酰胺之间相互调节提供了可能性.如前所述，ODA有一些大麻类的性质，同样，AEA也有与ODA类似的性质，如也可诱导大鼠睡眠^〔12〕.

　　FAAH是个膜结合酶^〔1〕，酶活性在肝脏最高，其次是脑和睾丸，在心脏、肾、肠、胃、肺、脾和骨骼肌中的活性很低^〔22〕.在肝和脑中的活性部位主要是微粒体部分.在小鼠脑中主要分布于新大脑皮质、海马、苍白球、扁桃体和小脑.在脑干和髓质中活性最低，此处CB₁受体也少^〔22〕.FAAH的分布在很大程度上是与大麻CB₁受体的分布相重叠的，可推测该酶使其底物ODA和AEA在其作用位点失活^〔12〕.

　　Cravatt等人已从大鼠肝内质网膜分离并纯化了FAAH，并找到其互补DNA，进行了克隆和酶活性表达.其cDNA由2473个残基组成，可编码形成一个分子量为63 300含579个氨基酸残基的蛋白质.经碱基库搜索表明，FAAH的蛋白序列与微生物来源的酰胺水解酶存在广泛的一致性.FAAH的cDNA在COS-7细胞中进行了表达，表达出的FAAH对ODA和AEA均有较高的水解活性^〔23〕.

　　4　脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）的抑制剂

　　自从ODA的诱导睡眠作用被发现以来，开展了大量关于FAAH及其抑制剂的研究工作，其目的一方面是研究ODA作用的分子机制，另一方面是开发具有新型作用机制的催眠药物.研究发现了FAAH的内源性抑制剂，也找到了一些合成抑制剂.

　　4.1　FAAH的内源性抑制剂

　　(R)－γ-溴代乙酰乙酸-2-辛酯(OγBr)是最初由人脑脊液分离出来的化合物,曾被发现存在于大鼠脑皮质、脑垂体、视网膜等组织，并发现可诱导猫的快动眼睡眠(REM).Patricelli等发现OγBr（R体）可竞争性地抑制FAAH的活性，IC₅₀值为2.6 μmol/L，Ki值为0.8 μmol/L.在pH 7.0时，OγBr的抑制作用比目前已知最强的FAAH合成抑制剂油酰三氟甲基酮还要强.根据OγBr在生理条件下的高抑制效力、它的组织分布和睡眠诱导作用，可以推测OγBr是FAAH的内源性调节剂.作者也实验了合成的OγBr类似物对FAAH的抑制活性，发现(R)-γ-氯代乙酰乙酸-2-辛酯、γ-溴代乙酰乙酸庚酯和γ-溴代乙酰乙酸-（Z-5-十四碳烯）-1-醇酯三个化合物在生理pH值下，与OγBr的抑制活性相当^〔24〕.

　　4.2　合成抑制剂的特点

　　有效的合成抑制剂一般都含有一个亲电性的羰基（羰基旁边有强吸电基）.推想酶的活性位点是丝氨酸或半胱氨酸残基，象丝氨酸蛋白酶一样，靠形成半缩醛过渡态而发挥催化作用.含亲电性羰基的抑制剂，可与酶的活性位点丝氨酸或半胱氨酸残基优先形成半缩醛，从而阻止了酶与底物形成复合物^{〔21,23,25〕}.

　　合成抑制剂的基本构效关系是：含有一个不短于14个碳原子的链，链上至少有一个顺式双键；羰基端应为酰胺、酯或酮，且不能带有较大的或芳香的取代基^〔12〕.

　　一些合成抑制剂用于动物实验，发现具有诱导大鼠睡眠的作用^〔21〕.

　　5　结论和展望

　　ODA作用的分子机制还远远没有搞清楚.5-HT_2A，5-HT_2C及5-HT_1A受体很明显是ODA的高选择性和高亲合性的靶点，但到目前为止，还没有找到它的专一性受体.ODA与大麻CB₁和CB₂受体亲合性不高，但表现出一些大麻样作用，目前以其对AEA的调控来解释.对ODA的生合成和组织分布还应进一步研究，这一方面目前还停留在假说的水平上，搞清楚这一点，对阐明诱导睡眠的分子机制和其他生理作用至关重要.对FAAH和其抑制剂的深入研究，有助于阐明ODA活性的体内调控机制，同时，也将为开发具有新型作用机制的催眠药提供先导化合物.

　　国家新药研究基金（No.97-Q-06）和辽宁省自然科学基金(No.9810500703)资助项目

参　考　文　献

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收稿日期:2000-06-19