肺结核病人特异性抗体分泌水平及CD23、CD40表达
中国病理生理杂志 1999年第1期第15卷 论著
作者：黄 瑾 王 珂 宫肇弟 李淑芳
单位：长春白求恩医科大学第二临床学院呼吸内科(长春 130041)
关键词：结核；肺；抗体；CD23抗原；CD40抗原
摘 要 目的：探讨肺结核病人B淋巴细胞活化状态。方法：采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)及细胞－酶联标记法测定了57例活动性肺结核病人特异性抗体分泌水平及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)CD23、CD40的表达。结果：(1)肺结核病人血清抗结素纯蛋白衍生物(purified protein derivation,PPD)抗体IgG、IgM水平明显低于健康对照；病人离体培养的PBMC在无PPD存在的条件下，所产生的IgG抗体明显高于健康对照，而加入PPD后IgG抗体分泌水平与健康对照无差别。(2)肺结核病人当天未经培养的PBMC CD23、CD40的表达明显低于健康对照；病人PBMC经体外培养10 d后，CD23、CD40的表达可明显提高；病人PBMC在加入PPD刺激后，其CD23的表达明显低于未加PPD刺激组，二者存在密切相关。结论：肺结核病人特异性抗体分泌水平降低可能与其B淋巴细胞处于低活化状态有关。
Observation on the specific antibody and CD23, CD40 expression
in patients with pulmonary tuberculosis
HUANG Jin,WANG Ke,GONG Zhao-Di,LI Shu-Fang
Department of Respiratory,2nd Teaching Hospital of Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun(130041)
Abstract AIM:Study the activation state of B lymphocytes in patients with pulmonary tuberculosis (TBP).METHODS:The specific antibody and CD23, CD40 expression on peripheral blood mononuclear cell (PBMC) in 57 active TBP were determined by the methods of ELISA and ELISA-cell.RESULTS:1.The serum anti-PPD IgG、IgM levels in TBP were remarkably decreased than that of the controls;The IgG levels produced by PBMC in patients cultured in vitro without PPD are remarkably higher than that of the controls. and in the condition of adding PPD no differences were found between patients and controls,2.Expression of CD23, CD40 on PBMC in patients that weren't cultured were significantly decreased than that of the controls;Expression of CD23,CD40 on PBMC in patients cultured in vitro for 10 days were significantly higher than that weren't cultured;Expression of CD23 on PBMC in patients that was cultured with PPD were decreased than that cultured without PPD,there was a close correlation between them.CONCLUSION:The reason of low levels of specific antibody in patients may be related to the low activation state of B lymphocytes.
MeSH Tuberculosis, pulmonary;Antibodies; CD23 antigens;CD40 antigens
抗结核菌抗体在结核病发生及转归中的作用，一直是人们关注的问题。但其在以细胞免疫反应为主的结核病变中却不占主导地位。其根本原因尚不清楚。CD23、CD40是标志B淋巴细胞活化状态的两种重要的白细胞表面抗原，主要分布于B淋巴细胞表面，可有效地介导B淋巴细胞的增殖、分化及免疫球蛋白的分泌［1，2］。为此，我们选用二者作为观察指标，利用我室建立的细胞－酶联标记法(待发表)，观察了肺结核病人B淋巴细胞的活化状态，以期从更深层次探讨结核病病因。
材料和方法
(一) 对象：所有病例均来自本校二院住院及门诊病人，共57例，男37例，女20例，年龄16～60岁，均为活动性肺结核，未用过激素治疗。诊断按1984年卫生部制定的诊断标准。对照组69例，均来自健康献血员，男38例，女31例，年龄20～45岁。
(二) 试剂：抗CD23单克隆抗体(anti-CD23 McAb)、生物素化羊抗鼠IgG、酶标记亲和素均购自北京军事医学科学院；抗CD40单克隆抗体(anti-CD40 McAb)购自Sigma公司；辣根过氧化酶标记羊抗人IgG、IgM购于北京生物制品所。
(三) 方法：
1.待测血清的采取及PBMC的分离：无菌取静脉血5 mL、肝素抗凝，密度梯度离心后，吸出血清层，－30℃冰箱冻存、待测；同时吸出单个核细胞层，Hanks液洗涤2遍，计数后备用。
2.PBMC的培养：将分离所得的PBMC取1.5×106细胞留当日用，其余细胞数调至1.5×106细胞／孔，置于24孔细胞培养板中，其中1孔加PPD，终浓度为2.5×103 U／L，另设1无PPD培养孔，置于5%CO2、37℃环境中培养10 d，收集上清及细胞，上清冻存备用，细胞留当日用。10 d中未予换液以保证上清中抗体浓度不变。
3.细胞－酶联标记法测定PBMC CD23、CD40的表达：将当日备用及(或)培养后收集的细胞离心、弃上清，在剩余细胞中加入1%戊二醛，4℃冰箱中固定15min。固定后的细胞离心后平分为3管，其中2管分别加入1∶10倍稀释的anti-CD23 MCAb 及anti-CD40 McAb，另1管为空白对照，均置于4℃冰箱中过夜、待测。已过夜的细胞离心后加入1%牛血清白蛋白封闭1h，然后将细胞离心加入1∶1000生物素化羊抗鼠IgG，置于37℃环境中2h，再将细胞离心，加入1∶1000酶标记亲和素，置于37℃环境中2h，将细胞洗涤烘干，试管内加底物缓冲液，移至40孔酶标板中，测OD490nm值。
4.血清及上清中特异性抗PPD抗体的测定。按常规间接ELISA方法。
结 果
一、血清中抗PPD IgG、IgM水平的观察及PPD对PBMC产生抗PPD抗体水平的影响：
活动性肺结核病人血清中抗PPDIgG、IgM抗体水平明显低于健康对照组(表1)。
肺结核病人体外培养的PBMC在未加入PPD时，其IgG抗体分泌水平明显高于健康对照，而加入PPD刺激后，IgG抗体水平与健康对照无差别(表2)，经统计学处理，发现PPD对病人及健康人PBMC产生抗PPD IgM抗体的影响不大。
表1 活动性肺结核与对照组血清中抗PPD抗体比较
Tab 1 Comparison of the serum anti-PPD antibody
levels between tuberculosis and control(
±s)
| Group |
n |
IgM |
IgG |
| Control |
38 |
0.41±0.15 |
1.22±0.32 |
| Tuberculosis |
36 |
0.29±0.16* |
0.99±0.39* |
*P＜0.01, vs control
表2 PPD对PBMC产生抗PPD IgG抗体的影响
Tab 2 The effect of PPD antigen on PBMC in
producing anti-PPD IgG antibody
| Group |
n |
Without PPD |
With PPD |
| Control |
21 |
0.88±0.36 |
0.76±0.30 |
| Tuberculosis |
20 |
1.21±0.18* |
0.85±0.53 |
*P＜0.01, vs control 二、PBMC CD23、CD40的表达情况：
肺结核病人当天未经培养的PBMC CD23的表达(0.14±0.15)明显低于健康对照组(0.29±0.19)；而其PBMC经体外培养10 d后，CD23的表达(0.29±0.26)与健康对照组(0.19±0.23)相比无明显差异；同时也看出，肺结核病人PBMC经体外培养10 d后CD23的表达与其当天未经培养组相比，明显提高(图1)。
fig 1 CD23 expression on PBMC(±s) (a) Tuberculosis；
(b) Control；**P＜0.01， vs control at same day；
＃ P＜0.05， vs tuberculosis at one day
图1 PBMC CD23的表达
肺结核病人当天未经培养PBMC CD40的表达(0.10±0.15)明显低于健康对照组(0.18±0.14)；而其PBMC经体外培养10 d后，CD40的表达(0.20±0.21)与健康对照组(0.17±0.18)相比无明显差异；同时也看出，肺结核病人PBMC经体外培养10 d后，CD40的表达与其当天未经培养组相比，明显提高(图2)。
Fig 2 CD40 expression on PBMC(x±s)
**P＜0.01， vs control at same day；
＃ P＜0.05， vs tuberculosis at one day
图2 PBMC CD40的表达
三、PPD对CD23、CD40表达的影响及相关性分析：
肺结核病人PBMC经PPD刺激培养组与无PPD刺激培养组相比，CD23的表达较低；而与当天未经培养组相比、CD23的表达无明显差异。健康对照组PBMC经PPD刺激培养组与无PPD刺激培养组相比，CD23的表达无明显差异；而与当天未培养组相比，CD23的表达较低(表3)。
表3 PPD对CD23表达的影响
Tab 3 Effect of PPD on the expression of CD23
| |
One day |
10 days |
| With PPD |
Without PPD |
| Tuberculosis |
0.14±0.15 |
0.14±0.14 |
0.28±0.26* |
| |
(n＝26) |
(n＝22) |
(n＝21) |
| Control |
0.28±0.19** |
0.15±0.13 |
0.19±0.23 |
| |
(n＝25) |
(n＝19) |
(n＝18) |
* P＜0.05， ** P＜0.01， vs with PPD
经统计学处理发现，肺结核病人与健康人当天PBMC及未经PPD刺激培养的PBMC CD40的表达与经PPD刺激培养组相比无明显差异。
肺结核病人与健康人PBMC未经PPD刺激组与经PPD刺激培养组CD23的表达均具有密切的相关性(P＜0.01)；健康人当天PBMC与经PPD刺激培养组CD23的表达也具有相关性(P＜0.05)。另外，健康对照组当天PBMC与未经PPD刺激培养组及经PPD刺激培养组CD40的表达均具有相关性(P＜0.05)。
讨 论
关于结核病人特异性抗体分泌水平，曾有许多报道，多认为有所提高［3，4］。我们首先观察了肺结核抗PPD IgG和IgM的血清水平。发现二者均明显低于健康对照。病人PBMC离体培养后，所分泌的抗体水平高于健康人，但同样加入PPD后，病人PBMC特异性抗体分泌水平明显下降，这一结果也与病人PBMC离体培养后CD23、CD40的表达明显提高，而加入PPD刺激培养后CD23的表达下降结果相符。
CD23即IgE低亲和力受体／FcεR，该分子的主要作用是能够向细胞内传递与细胞增殖和分化有关的化学信号，调节B细胞的增殖和分化［1］；CD40是CD40／肿瘤坏死因子受体(TNFR)或神经生长因子受体(NGFR)超家族成员之一，CD40与其配体(CD40Liand,主要分布于活化的T淋巴细胞)是目前令人瞩目的一对分子，二者的相互作用，可有效地促进抗体产生及同种型转换［5，6］。
通过研究发现，病人PBMC CD23及CD40表达明显低于健康对照，同样，病人PBMC离体培养后CD23、CD40表达在无PPD存在条件下明显提高，而加入PPD后可以看出，PPD不但可以影响肺结核病人也可影响健康人CD23的表达，但PPD影响二者的环节不一致，PPD影响CD23表达的机制尚待进一步探讨。另外，从相关性分析来看，PPD对PBMC CD23、CD40的表达皆有相关。
我们认为，肺结核病人抗PPD抗体的分泌水平低于健康人，其降低原因可能是B淋巴细胞活化低下所致，另外也可能与病人的感染状况有关。病人B淋巴细胞活化状态低下与PPD的存在明显相关，并且解除该因素后，CD23、CD40的表达可恢复正常，特异性抗体的分泌也明显提高。
参考文献
1 陈欣洁，徐德胜.CD23与B细胞分化.国外医学免疫学分册，1996，19：20.
2 Splawski JB,FuSM,Lipsky PE.Immunoregulatory role of CD40 in human B cell differentiation.J Immunol,1993,150:1276.
3 黄蓉蓉.酶联免疫吸附试验检测肺结核病人血清抗体的初步研究.中华结核和呼吸杂志，1983，6：351.
4 Termer M.Humoral immune response in human tuberculosis:Immunoglublines G,A and M directed against the purified 12 protein antigen of mycobacterial bovis Bacillus Calmette G verin. J C lin Microbiol,1988,27:1714.
5 王艳华.CD40和CD40配体的研究进展.国外医学免疫学分册，1996，19：22.
6 Armitage R J, Macduff B M,Spriggs M.K.Human B cell proliferation and Ig secretion induced by recombinant CD40 ligand are modulated by soluble cytokines. J Immunol,1993,150:3671.
收稿日期：1996年11月13日
修稿日期：1997年8月5日
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