抗Fas单抗和Bcl-2反义脱氧寡核苷酸诱导小儿急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的研究

中华儿科杂志 1999年第1期第0卷 论著

作者：王昭　殷慧君　李虹　商晓云

单位：100044 北京医科大学附属人民医院儿科(王昭现在100050 首都医科大学附属北京友谊医院)

关键词：脱噬作用；抗体；单克隆；白血病；淋巴细胞性；急性

　　【摘要】　目的　探讨抗Fas单抗、Bcl-2反义脱氧寡核苷酸在诱导小儿急性淋巴细胞白血病(简称急淋)细胞凋亡中的作用。方法　小儿急淋白血病细胞分别与Bcl-2反义脱氧寡核苷酸、抗Fas单抗培养，或与两者一起培养，再分别定量检测其凋亡细胞。结果　Bcl-2反义脱氧寡核苷酸或抗Fas单抗分别与17例及8例小儿急淋白血病细胞培养48小时后，能各自诱导(35.7±9.4)%及(39.4±8.2)%细胞凋亡。当它们共同作用于8例小儿急淋白血病细胞时可诱导(69.8±13.1)%白血病细胞凋亡。结论　Bcl-2反义脱氧寡核苷酸与抗Fas单抗均能诱导小儿急淋白血病细胞的凋亡，二者联合应用可显著加强其诱导凋亡的作用。

　　Apoptosis of leukemic cells induced by anti-Fas monoclonal antibody and Bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides in childhood acute lymphocytic leukemia　WANG Zhao, YIN Huijun, LI Hong, et al. Department of Pediatrics, Peoples′s Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044

　　【Abstract】　Objective　To explore the function of anti-Fas monoclonal antibody (MoAb) and Bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides (ASON) in mediating apoptosis of childhood acute lymphocytic leukemia (ALL)cells.Methods　The percentage of apoptotic cells was detected after childhood ALL cells were incubated with Bcl-2 ASON, anti-Fas MoAb or with both of them, respectively.Results　All cells were incubated with Bcl-2 ASON (17 samples) or anti-Fas MoAb (8 samples) for 48 hours, and the percentage of apoptotic leukemic cells reached to (35.7±9.4)% and (39.4±8.2)% respectively. The ratio of apoptotic cells from the 8 ALL samples increased to (69.8±13.1)% when they were incubated with both Bcl-2 ASON and anti-Fas MoAb.Conclusion　The use of both Bcl-2 ASON and anti-Fas MoAb may probably provide an effective method for clinical treatment of childhood acute lymphocytic leukemia.

　　【Key words】　Apoptosis　　Antibodies, monoclonal　　Leukemia, lymphocytic, acute

　　现已证明细胞凋亡调控基因与白血病的发生发展有着密切的关系^［1］。近来的研究表明，Fas基因、Bcl-2基因都参与了细胞凋亡的调控^［2，3］。我们通过特异反义脱氧寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASON)阻断小儿急性淋巴细胞白血病(简称急淋)细胞Bcl-2的表达以及抗Fas单抗(anti-Fas monoclonal antibody, anti-Fas MoAb)激活Fas受体，从而诱导小儿急淋白血病(acute lymphocytic leukemial,ALL)细胞的凋亡以探讨白血病发病机理并为临床治疗小儿急淋白血病提供理论及实验依据。

材料和方法

　　一、材料

　　1.标本来源：17例初治小儿急淋白血病细胞和5例正常小儿骨髓细胞来源于北京医科大学附属人民医院儿科。

　　2.试剂：(1)Bcl-2硫代ASON及Bcl-2硫代有义脱氧寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,SON)均由美国Gyber Syn公司合成。(2)抗Fas单抗由日本金泽大学医学院生化室提供。

　　二、方法

　　1.细胞培养：每例骨髓标本均采用淋巴细胞分层液提取单个核细胞，然后分组置于37℃、5%CO₂、100%湿度的孵箱中培养。其细胞培养密度为1×10⁶/ml。

　　2.Bcl-2 ASON对白血病细胞凋亡的影响：将17例小儿急淋白血病细胞及5例正常小儿骨髓单个核细胞均分成ASON组、SON组及空白对照组。分别与5 μmol ASON或5 μmol SON共培养48小时，并用TUNEL法检测凋亡细胞。

　　3.anti-Fas MoAb单独或与Bcl-2 ASON共同诱导白血病细胞凋亡：17例标本中的8例小儿急淋白血病细胞先与5 μmol Bcl-2 ASON培养24小时后，再加500 ng/ml anti-Fas MoAb培养24小时，或者仅与MoAb(500 ng/ml)培养48小时，同时设立空白对照组(ALL细胞培养液中既不加Bcl-2 ASON，也不加anti-Fas MoAb)，用TUNEL法检测凋亡细胞。

　　4.TUNEL法检测凋亡细胞^［4］：(1)将细胞稀释适当浓度，均匀涂在硅化的载玻片上。(2)用10%福尔吗林室温下固定10分钟，然后用10 μg/ml蛋白酶K消化10分钟。(3)洗片后，滴加末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)及Biotin-11-dUTP各1 μl.并加入8 μl标记缓冲液。(4)洗片，滴加羊血清封闭10分钟。(5)滴加avidin-HRP工作液50 μl，37℃湿盒中反应30分钟。(6)洗片，用甲基绿衬染未凋亡的细胞。

　　5.凋亡细胞镜检：经TUNEL法检测，细胞涂片中胞核为深棕色的即是凋亡细胞。在显微镜下，每张细胞涂片观察3个视野，每个视野连续数100个细胞，计算凋亡细胞百分比及其标准差。

结果

　　一、ASON对小儿急淋白血病细胞及正常淋巴细胞凋亡的影响(表1)

　　急淋白血病细胞Bcl-2 ASON组、Bcl-2　SON组以及空白对照组细胞凋亡百分比分别为：(35.7±9.4)%、(9.7±2.0)%及(10.0±2.4)%。经方差分析及t检验发现Bcl-2 ASON能明显诱导17例小儿急淋白血病细胞凋亡，并与SON组、空白对照组之间的差异有非常显著意义(P＜0.01)。而SON组与空白对照组之间差异无显著性(P＞0.05)。另外，实验还发现小儿急淋白血病细胞对Bcl-2 ASON的敏感性明显高于正常淋巴细胞，更易被Bcl-2 ASON诱导凋亡。

表1　两类细胞不同培养组的凋亡细胞

　　百分比及比较(±s，%)

　　注：^*与ASON比较，P＜0.01

　　二、anti-Fas MoAb与Bcl-2 ASON共同诱导小儿急淋白血病凋亡的情况(表2)

　　8例小儿ALL细胞分为3组：(1)ASON＋anti-Fas MoAb组：白血病细胞与Bcl- 2 ASON培养24小时后，再加入Fas MoAb培养24小时。结果，凋亡ALL细胞百分比为(69.8±13.1)%。(2)anti-Fas MoAb组：ALL细胞仅与anti- Fas MoAb培养48小时。凋亡ALL细胞百分比为(39.4±8.2)%。(3)空白对照组：8例ALL细胞培养液中既无Bcl-2 ASON也无anti-Fas MoAb。培养48小时后凋亡ALL细胞百分比为(15.5±5.5)%。经随机区组F检验，3种培养组凋亡细胞百分比差异有非常显著意义(F=53.46,P＜0.01)，其中ASON＋anti-Fas MoAb组高于anti-Fas MoAb组，后者又高于空白对照组。

表2　8例小儿急性白血病细胞不同培养条件下

　　细胞凋亡百分比及比较(±s，%)

　　^* P＜0.01

讨论

　　最近越来越多的证据表明，细胞凋亡是由多种可能促进细胞死亡或延长细胞生存期的基因产物所控制的。在这些基因产物中，Fas基因编码的细胞表面膜受体在Fas配体或抗Fas单抗作用下，形成三聚体，从而启动细胞凋亡^［5］。另外一个重要基因是Bcl-2原癌基因，Bcl-2基因蛋白产物能够抑制许多因素引起的凋亡。例如血清和生长因子的缺乏、质膜过氧化反应、钙离子通道失控以及C-myc,p53等因素引起的细胞凋亡^［6］。

　　我们的实验发现，Bcl-2特异ASON能诱导小儿急淋白血病细胞凋亡，且显著高于SON及空白对照组(P值均＜0.01)。而SON组与空白对照组之间差异无显著性(P＞0.05)。小儿急淋白血病细胞较正常骨髓淋巴细胞更易被Bcl-2反义脱氧寡核苷酸诱导凋亡。相反空白对照组及SON组中，正常淋巴细胞较急淋白血病细胞更易凋亡，差异有非常显著意义(P＜0.01)。这表明Bcl-2反义脱氧寡核苷酸能特异诱导白血病细胞凋亡而对正常淋巴细胞的作用相对小的多^［7］。Campos等^［8］利用特异ASON阻断急性髓性白血病细胞Bcl-2表达，发现ASON不仅能特异下调Bcl-2蛋白，而且能使髓性白血病细胞存活时间缩短。另外，他们也发现ASON能加强化疗药物对白血病细胞的杀伤作用。

　　本研究发现抗Fas单抗能明显诱导小儿急淋白血病细胞凋亡。最近有人报道，Fas受体与抗Fas单抗结合后，引起Ca²⁺快速从内质网流出进入胞浆以及胞外Ca²⁺内流。胞浆内Ca²⁺浓度升高直接激活依赖Ca²⁺/Mg²⁺的内源性核酸内切酶，导致DNA断裂及细胞凋亡^［9］。

　　尽管目前由于化疗方案的改进和新型化疗药物的应用，使小儿急淋白血病的缓解率有了很大提高。但仍有些病例的化疗效果不尽人意，有些白血病细胞对化疗药物敏感性差而不易被杀死。因而寻求一种能促使白血病细胞凋亡或增加其对化疗药物敏感性的辅助治疗手段对小儿急淋白血病的临床缓解直至彻底治愈有着重要意义。我们的实验结果表明，Bcl-2特异反义脱氧寡核苷酸、抗Fas单抗都能诱导小儿急淋白血病细胞凋亡，而且如果联合应用，则可显著加强它们诱导白血病细胞凋亡的作用。

　　本课题由国家自然科学基金资助(基金项目编号：39670769)

　　 参考文献

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　　[8]　Campos L, Sabido O, Rouault JP, et al.Effect of BCl-2 antisenseoligodeoxynucleotides on in vitro proliferation and survival of normal marrow progenitors and leukemic cells. Blood,1994,84:595-600.

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(收稿：1997-12-18　　修回：1998-05-15)