卵巢癌抗独特型抗体/hGM-CSF融合蛋白质对体外免疫细胞的刺激作用

北京医科大学学报 1999年第1期第31卷 论著

作者：杨飞雪　钱和年　刘　蓓

单位：北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100034

关键词：抗体；抗独特型；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；重组融合蛋白质类；药理学；免疫；细胞；药物作用；卵巢肿瘤；免疫学

　　摘　要　目的：探讨卵巢癌抗独特型单链抗体6B11 scFv/hGM-CSF融合蛋白质(6B11 GM)作为肿瘤疫苗的可能性。方法：采用体外T细胞增殖试验，对6B11 GM刺激T细胞的能力进行测定，并用流式细胞仪对T细胞表型及APC MHC Ⅱ表达情况进行测定，测定了外周血单个核细胞经6B11 GM激活后对卵巢癌细胞系的非MHC限制的杀伤活性。结果：6B11 GM及6B11均能引起特异的T细胞增殖，但6B11 GM组的增殖明显高于6B11组，以CD4⁺增殖为主。6B11 GM能明显增加抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)的MHCⅡ表达，使APC更有效地摄取抗原，激活非MHC限制的杀伤活性。结论：6B11 GM能引起细胞免疫反应，作为疫苗具有良好的前景。

　　中国图书资料分类法分类号　R737.31

in vitro study of the stimulative effect of ovarian cancer anti-idiotypicantibody 6B11 scFv/hGM-CSF fusion protein on immunocytes

　　YANG Fei-Xue, QIAN He-Nian, LIU Bei

　　(Gynecological Oncology Center, People's Hosiptal, Beijing Medical University, Beijing　100034)

　　MeSH　Antibodies, anti-idiotypic　　Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor　　Recombinant fusion protein/pharmacol　　Immunity, cellular/drug eff　　Ovarian neoplasm/immunol

　　ABSTRACT　Objective: To explore the possibility of an anti-idiotypic antibody/human GM-CSF fusion protein (6B11 GM) used as tumor vaccine for ovarian cancer.Methods: In vitro T cell proliferation to determine the capacity of 6B11　GM to stimulating T cells; T cell phenotype and the MHC Ⅱ expression of antigen presenting cell (APC) were determined with flow-cytometry. Cytotoxity of primed mononuclear cells was investigated using trypan blue with the ovarian cancer cell line SKOV3 and the K562 as target cells.Results: Both 6B11 and 6B11 GM could stimulate special T cell proliferation, however 6B11 GM was advanced at the proliferation level. CD4⁺ T cells were predominate among the proliferation cells.　6B11 GM could significantly enhance the MHC Ⅱ expression of APC. An in vitro non-MHC-restricted cytotoxic function could be effectively activated with 6B11 GM and 6B11. When compared with 6B11, 6B11 GM was more likely to be taken up by APC.Conclusion: 6B11 GM can stimulate cellular immunity, and therefore may be used as tumor vaccine for ovarian cancer.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:9-12)

　　抗独特型疫苗作为肿瘤疫苗已用于临床，在结肠癌等肿瘤治疗中取得良好疗效。与其他疫苗相比，具有易制备、不易被肿瘤病毒污染等优点。但由于模拟的抗原表位有限，免疫原性弱。6B11是本实验室制备的模拟卵巢浆液性囊腺癌表面抗原的抗独特型抗体。在构建卵巢癌抗独特型单链抗体（6B11 scFv）的基础上，又构建了表达6B11 scFv与hGM-CSF的融合蛋白质^［1］。本文对6B11 GM作为卵巢癌肿瘤疫苗的可能性进行初步探讨。

　　1　材料与方法

　　抗体及细胞因子：6B11单抗及融合蛋白质6B11 GM［基因工程产品,相对分子质量(M_r)4.3×10⁴, 其中GM-CSF　M_r 1.4×10⁴］，本室制备。小鼠IgG，购自军事医学科学院。hGM-CSF， 北京医科大学免疫学系马大龙教授惠赠。

　　T淋巴细胞和抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)细胞的分离制备：正常自愿者2名取静脉血15 ml，加1.5 ml的20 g*L^－1 EDTA抗凝，PBS等体积稀释后，加等体积的单个核细胞分离液，分离单个核细胞，培养2 h，吸取非粘附细胞，过尼龙毛柱，分离T细胞。用力吹打，吸取粘附细胞（做为APC）。

　　细胞系：卵巢癌细胞SKOV3(ATCC), 能与COC166-9（6B11的一抗）特异结合。宫颈癌细胞系HeLa细胞，本室保存，COC166-9阴性细胞。K562细胞，NK敏感细胞株。

　　淋巴细胞增殖实验：在96孔培养板上每孔加入T细胞1×10⁵，APC1×10⁵（30Gy照射），每孔再加6B11 GM(100μg^.L^－1)，6B11(100μg^.L^－1), 6B11(100μg^.L^－1)+GM-CSF(33μg^.L^－1),GM-CSF(33μg^.L^－1)或IgG(100μg^.L^－1)，平行3孔。（1）初次反应：37℃培养5d后，加MTT(1g^.L^－1)20 μl, 37℃ 4h，用酸性SDS溶解后测570 nm处吸光度(A)。（2）再次反应：37℃培养5d后，分别加入SKOV3(30 Gy高能X线照射，使用前反复冻融3次) 1×10⁵，37℃培养过夜，加MTT(1g^.L^－1)20μl,37℃4h，用酸性SDS溶解后测A₅₇₀。

　　T细胞表型分析：小鼠抗人CD3，CD4，CD8均购自中山公司，按说明书操作。

　　APC HLA-DR表达测定：分离APC，如前述。分别加入100 μg^.L^－1 6B11及6B11GM，孵育4～5d后，流式细胞仪测HLA-DR表达。小鼠抗人HLA-DR购自中山公司，按说明书操作。

　　6B11　GM融合蛋白质对APC摄取抗原的影响：6B11sGM和6B11，分别与APC 37 ℃孵育2 h。加COC166-9，4 ℃孵育1 h后，加FITC标记的羊抗鼠IgG。上机测定荧光标记细胞数。

　　非MHC限制的杀伤试验和冷靶抑制试验：正常人外周单个核细胞，与IgG, 6B11, 6B11 GM及GM-CSF（浓度与淋巴细胞增殖试验同）共同孵育5 d后，收集淋巴细胞。调整细胞水平，在96孔板中加淋巴细胞5×10⁵，SKOV3 5×10³（效∶靶＝100∶1）。于8、12、16　h观察细胞情况。20　h后台盼蓝染色计数100个SKOV3细胞中的死细胞数(杀伤)。同时设对照孔，对照孔加K562，效靶比为40∶1（冷靶抑制），NK杀伤＝杀伤－冷靶抑制。

　　统计学分析：采用t检验和χ²检验。

　　2　结果

　　T细胞分离：分离的T细胞经流式细胞仪测定CD3^＋细胞占93％。

　　T细胞增殖反应：在初次反应中，6B11 GM，6B11和对照小鼠IgG刺激T细胞增殖的强度无明显区别，而当用COC166-9阳性的卵巢癌细胞株SKOV3再次刺激时，6B11 GM、6B11组T细胞增殖的幅度明显高于对照IgG及GM-CSF组，且6B11 GM组又高于6B11组而与6B11+GM组相似(图1)。而用HeLa细胞刺激时，无明显的再次增殖反应。

*P＜0.05 vs IgG group； NS，P＞0.05 vs IgG group；

　　▲P＜0.05 vs 6B11 group．

1　体外T细胞增殖反应

　　Figure 1　In vitro T cell proliferation primed by

　　the 6B11 GM and rechallenge with SKOV3

　　6B11 GM对T细胞表型的影响：在6B11 GM引起的T细胞增殖反应中，初次反应和再次反应均以CD4⁺为主(表1)。

表1　增殖反应前后T细胞表型分析

　　Table 1　The phenotypic assay of primed T cell from donors

　　／％

　　6B11 GM对APC MHC Ⅱ分子表达的影响：No.1 APC HLA-DR基础表达水平30.8%,6B11组32.3%,6B11 GM组37.4%;No.2 APC HLA-DR基础表达水平38.5%, 6B11组49.0%,6B11 GM组65.2%。6B11能使APC的MHC Ⅱ表达明显增加, 6B11对APC MHC Ⅱ的表达无明显影响。

　　6B11 GM对APC摄取抗原的影响：与6B11＋GM-CSF组相比较，经6B11 GM孵育的细胞，能被COC166-9检测的细胞数更高，分别为54.2%和37.2%, 表明融合蛋白质更易被APC吸附摄取。

　　刺激后外周血单个核细胞的杀伤作用：6B11 GM和6B11，6B11刺激组单个核细胞与SKOV3孵育8 h后，出现单个核细胞包绕肿瘤细胞18 h后细胞形态不清(图2)。其余组无此现象。20 h后台盼蓝计数死细胞(表2)。

12 hours after co-incubation of mononuclear cells with SKOV3,

　　E-rosette like cell groups formed.

2　6B11GM刺激的外周血单个核细胞对SKOV3的细胞毒作用　×40

　　Figure 2　The cytotoxity of 6B11GM primed mononuclear

　　cells to SKOV3　×40

表2　外周血单个核细胞对SKOV3的杀伤作用

　　Table 2　The cytotoxity of primed mononuclear cells to SKOV3

　　determined by trypan blue

　　/%

NK=SKOV3－(SKOV3+K562); *P＜0.05 vs IgG group.

　　3　讨论

　　抗独特型抗体用作肿瘤主动免疫主要是基于Jener's的网络理论，根据这一理论，抗独特型抗体可作为网络抗原引起特异体液和细胞免疫反应。近来一些研究表明，抗独特型抗体除了在空间结构上模拟抗原，还可在其CDR区再现抗原的一级结构，模拟T细胞抗原^［2］，为抗独特型抗体作为疫苗提供了分子基础。但由于模拟的表位有限，免疫源性弱。单链抗体的产生使抗体适于临床应用，因为去除了Fc段，减少了产生HAMA的可能性。而同时，其免疫源性进一步下降。而GM-CSF对免疫反应的促进作用已得到证实^［3］。为此，我们构建了融合蛋白质,探讨6B11 GM能否增加免疫原性、细胞免疫反应及其可能途径。

　　在初次反应中，6B11，6B11 GM以及作为对照的小鼠IgG均能刺激T细胞增殖。而当用表达初始抗原的卵巢癌细胞系再次刺激时，对照组无明显增殖，而6B11和6B11 GM组表现明显的增殖反应，这一结果表明，抗独特型抗体能模拟抗原，引起特异的T细胞反应。Duwan等^［4］的研究也得到类似的结果。

　　在初次反应和再次反应中，6B11　GM的增殖强度均高于6B11，而与6B11＋GM-CSF组相似，说明6B11与GM-CSF偶联在增强免疫原性作用中并非必需。一些研究对GM-CSF修饰的瘤细胞瘤苗作用机制进行了研究，发现GM-CSF是以旁分泌的形式起作用， 而这种作用可被注射瘤苗同时注射长期缓慢释放的GM-CSF所替代^［5］。Levy等^［6］报道， 动物整体实验中，独特型疫苗必需和GM-CSF构成融合蛋白质才能诱导保护性免疫反应。可能在全身应用时，抗原提呈局部GM-CSF未能达到一定浓度。通过融合蛋白质形式的意义可能在于局部的高GM-CSF环境，而避免由高浓度带来的全身反应或其它免疫佐剂给机体带来的毒副作用。我们的结果也表明，以融合蛋白质的形式能使APC更有效地摄取抗原。这可能与APC表达GM-CSF受体，融合蛋白质中的GM-CSF起“分子桥”的作用有关。

　　肿瘤主动免疫治疗的目标是诱导机体产生特异的CD4^＋或CD8^＋阳性T细胞，直接或间接杀伤肿瘤细胞。本实验中，6B11引起的细胞增殖以CD4^＋为主，且这种作用可被GM-CSF增强，融合蛋白质中的GM-CSF能使APC表达HLA-DR增加。说明对T细胞的增殖作用是通过MHCⅡ途径。抗独特型抗体能引起抗原特异T细胞增殖，包括Th、Ts和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte, CTL)^［7］，分泌IL-2^［8］。本室以前的实验也表明6B11能引起迟发过敏反应(delayed-type hypersensitivity, DTH)^［9］，而此次体外实验又诱导了CD4增殖，说明抗独特型抗体可引起Th增殖。本研究中观察到6B11及融合蛋白质能激活非MHC限制的杀伤，其中以NK为主但也有其它细胞和因子参与。Buckley等对结肠癌病人术前用抗独特型抗体治疗，术后对肿瘤浸润淋巴细胞作了免疫组化分析，对外周血和引流区淋巴结淋巴细胞作了效应细胞功能分析，发现在肿瘤部位有活化的CD4⁺和NK，而一般情况下，NK很少见于结肠癌组织。同时大部分病人NK活性和自身肿瘤细胞杀伤活性增加^［10］。说明抗独特型抗体除了诱导CD4⁺增殖，直接分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞，有可能也通过CD4⁺分泌的细胞因子或其它途径激活NK，对NK有趋化作用。综上所述，6B11 GM在体外实验中能通过MHC Ⅱ途径激活CD4⁺，诱导非MHC限制的杀伤，融合蛋白质中的GM-CSF除了对APC的直接促进作用，还可起到分子桥的作用，使融合蛋白质更易被APC摄取。以上结果表明，6B11 GM具有作为肿瘤疫苗的前景，为卵巢癌的治疗提供了一种新途径。

　　*　国家自然科学基金(36670755)资助项目。

　　参考文献

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（1998-04-07收稿)

　　(本文编辑：景　霞　周传敬)