极大螺旋藻胞内多糖对人血癌细胞生长的影响
中草药 1999年第2期第30卷 药理实验与临床观察
作者：刘宇峰 张成武** 沈海雁*** 李 恒 魏海燕
单位：南京大学医学院(210093)；**南京化工大学生物技术与科学系；***南京大学生物科学与技术系。
关键词：极大螺旋藻胞内多糖；半固体琼脂培养法；MTT法；U937；HL-60
摘 要 应用半固体琼脂培养法和MTT法研究了极大螺旋藻胞内多糖对人血癌细胞U937和HL-60的影响。实验结果显示，对体外生长的U937细胞有促进生长的作用，而对体外生长的HL-60细胞有抑制生长的作用。提示极大螺旋藻胞内多糖对人的血癌细胞的生长有明显的影响。
Effects of Intracellular Polysaccharide from Spirulina maxima on the
Growth of the Human Leukemia Cells
Liu Yufeng, Zhang Chengwu, Shen Haiyan，et al.
(Medical College of Nanjing University, Nanjing 210093)
Abstract The effects of polysaccharides from Spirulina maxima on the growth of human leukemia cells were studied by semi-solid agar culture and MTT staining. The results showed that the polysaccharides could significantly promote the growth of U937 cells and retard the growth of HL-60 cells, especially at concentraions of 60 and 15 nmol/L, which suggested that the polysaccharides from Spirulina maxima could obviously affect the growth of human leukemia cells.
Key words polysaccharides from Spirulina maxima semi-solid agar culture MTT staining human leukemia HL-60 and U937
多糖不仅是所有生物有机体的重要结构成分，而且也是一种重要的信号或信息分子的受体，参与分子识别、细胞粘着及细胞的防御机制〔1〕。近年来，随着糖科学和糖技术的发展，藻类多糖与其它多糖一样，在作为医药产品方面已日益为人们所重视〔2〕。钝顶螺旋藻Spirulina platensis多糖能够提高机体免疫功能〔3〕，能够增强小鼠骨髓细胞增殖能力，减轻小鼠骨髓细胞的辐射遗传损伤〔4，5〕，并能明显抑制体内移植性癌细胞的增殖〔6〕。
极大螺旋藻Spirulina maxima来源于美国Texas大学藻种保藏中心，其胞内多糖分子量为1.3×106，主要由葡萄糖(67.7%)、岩藻糖(16.8%)、葡萄糖醛酸(15.5%)组成，并含9种氨基酸，其糖苷键构型为α型。为了研究该多糖是否能够作为肿瘤抑制药物的可能性，我们研究了极大螺旋藻胞内多糖对人血癌细胞的影响。
1 材料
极大螺旋藻胞内多糖：南京化工大学生物技术与科学系张成武提供；RPMI1640培养液：美国Gibco公司产品；Hepes:美国Sigma公司产品；小牛血清：杭州四季青生物材料研究所产品；琼脂糖：上海化学试剂采购站经销产品；MTT：美国Sigma公司产品；肿瘤细胞株(U937、HL-60)：中科院上海细胞所提供。
2 方法
2.1 半固体琼脂培养法〔7〕：下层琼脂糖浓度为0.5%，含16%RPMI 1640(4X)、20%小牛血清。上层琼脂糖浓度为0.3%，除含与下层相同浓度的RPMI 1640和小牛血清外，还含有肿瘤细胞4×103/mL、不同浓度的极大螺旋藻多糖(共设60、15、3.8、0.96和0.24 nmol/L 5个浓度组，每组设10个相同样本)，对照则不加多糖。在37 ℃、5%CO2浓度条件下培养第4、6、8、10日，计数各样本的细胞集落数(大于20个细胞的细胞团为一个集落)。
2.2 MTT法〔8〕：将肿瘤细胞悬液1 mL加到24孔培养板中(2×104/mL)，加入不同浓度的极大螺旋藻多糖(设60、15、3.8、0.96和0.24 nmol/L 5个浓度组，每个浓度设6个相同样本)，置37 ℃、5%CO2条件下培养至第4、6、8、10、12日，从每孔取100 μL细胞悬液，加到另一96孔培养板中，每孔加25 μL MTT(5 mg/mL)，置37 ℃继续培养4 h，每孔加100 μL溶解液终止反应，置37 ℃过夜，第2日于波长570 nm处测OD值。
3 结果
3.1 对U937细胞集落的影响：见表1。第8日60和15 nmol/L浓度组的集落数与对照组间存在显著差异，第10日则存在极显著的差异，第10日3.8 nmol/L浓度组与对照组间也存在着极显著的差异，其它实验组与对照组间无显著差异。
表1 极大螺旋藻胞内多糖对U937细胞集落数的影响(n=10)
| 多糖浓度 |
培养天数(d) |
| (nmol/L) |
4 |
6 |
8 |
10 |
| 对照 |
9.7±0.95 |
9.9±1.79 |
7.9±1.52 |
5.9±1.73 |
| 0.24 |
9.4±2.01 |
8.5±1.08 |
8.0±1.89 |
6.4±1.43 |
| 0.96 |
9.8±1.55 |
9.6±1.65 |
8.3±2.31 |
7.4±1.07 |
| 3.8 |
10.0±1.15 |
10.3±1.49 |
7.9±1.45 |
8.9±2.02** |
| 15 |
11.4±1.90 |
10.7±1.34 |
10.1±2.02* |
10.3±2.16** |
| 60 |
10.8±2.10 |
11.8±1.87 |
9.9±1.73* |
9.9±2.42** |
与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01(下同) 3.2 对U937细胞MTT OD值的影响：见表2。60 nmol/L浓度组在第6、8、10、12日与对照组间都存着极显著的差异，15 nmol/L浓度组在第6、12日与对照组间存在显著差异，而第8、10日则存在极显著的差异，3.8 nmol/L浓度组在第8日与对照组间存在显著差异，第10日则存在非常显著差异，其它实验组与相应对照组之间没有差异。
表2与表1相比较，二者的结果总的来说是一致的，实验组60和15 nmol/L浓度组与对照组间差异极显著，且在一时间范围内，多糖对U937细胞的影响随着培养时间延长而增强。
3.3 对HL-60集落形成的影响，见表3。60、15、3.8 nmol/L浓度组在第4、6、8、10日与对照组间都存在极显著的差异，0.96 nmol/L浓度组在第4、6日与对照组间存在显著差异，而在第8、10日则存在极显著差异，0.24 nmol/L浓度组在第10日也与对照组间存在极显著差异。
3.4 对HL-60细胞MTT OD值的影响：见表4。60 nmol/L浓度组在第6、8、10、12日与对照组间存在极显著的差异，15 nmol/L浓度组在第6日存在显著差异，而在第8、10、12日都存在极显著的差异，3.8 nmol/L浓度组在第8、10、12日都存在极显著的差异，0.96和0.24nmol/L浓度组则在第10日分别存在极显著差异和显著差异。
表2 极大螺旋藻胞内多糖对U937细胞MTT OD值的影响(OD×100)(n=6)
| 多糖浓度 |
培养天数(d) |
| (nmol/L) |
4 |
6 |
8 |
10 |
12 |
| 对照 |
23.50±1.69 |
33.22±2.10 |
35.38±2.92 |
40.62±3.26 |
42.50±4.77 |
| 0.24 |
20.88±1.64 |
29.10±1.60 |
30.13±2.70 |
39.78±3.78 |
48.38±5.63 |
| 0.96 |
22.75±3.69 |
29.25±1.58 |
38.25±3.77 |
44.27±3.28 |
47.13±4.17 |
| 3.8 |
24.75±2.92 |
34.00±5.13 |
42.38±3.60* |
53.13±5.10** |
50.38±6.27 |
| 15 |
19.38±1.66 |
39.16±3.16* |
45.88±3.36** |
65.38±5.13** |
51.75±5.47* |
| 60 |
18.63±1.16 |
42.62±3.63** |
52.63±4.67** |
92.75±7.23** |
59.38±5.20** |
表3 极大螺旋藻胞内多糖对HL-60细胞集落形成的影响(n=10)
| 多糖浓度 |
培养天数(d) |
| (nmol/L) |
4 |
6 |
8 |
10 |
| 对照 |
5.7±1.06 |
6.4±1.51 |
7.7±1.16 |
9.6±2.01 |
| 0.24 |
5.4±0.84 |
5.8±0.92 |
7.0±0.94 |
7.5±1.65** |
| 0.96 |
4.6±1.07* |
5.3±0.82* |
5.5±0.97** |
6.4±1.17** |
| 3.8 |
4.6±1.26** |
4.9±1.10** |
4.2±1.23** |
5.6±0.97** |
| 15 |
4.0±0.94** |
3.8±1.14** |
4.5±1.08** |
4.0±0.82** |
| 60 |
2.1±0.88** |
1.8±0.79** |
2.2±0.79** |
1.5±0.53** |
表4 极大螺旋藻胞内多糖对HL-60细胞MTT OD值的影响(OD×100)(n＝6)
| 多糖浓度 |
培养天数(d) |
| (nmol/L) |
4 |
6 |
8 |
10 |
12 |
| 对照 |
20.25±1.96 |
92.75±4.15 |
132.25±2.49 |
107.00±3.94 |
57.03±1.71 |
| 0.24 |
20.50±1.91 |
93.50±2.60 |
134.85±2.17 |
97.25±5.58* |
58.33±5.22 |
| 0.96 |
20.00±2.45 |
92.75±3.11 |
127.25±4.44 |
86.50±3.23** |
56.25±2.17 |
| 3.8 |
21.75±3.40 |
88.13±1.23 |
125.75±2.49** |
86.00±4.53** |
52.04±1.22** |
| 15 |
21.25±2.63 |
86.73±1.79* |
121.50±3.20** |
78.75±4.97** |
51.03±2.01** |
| 60 |
18.75±3.77 |
80.76±1.10** |
108.43±2.51** |
85.24±3.77** |
50.51±4.50** |
表4与表3相比，该多糖对HL-60的影响总的来说也是一致的，即60和15 nmol/L浓度组影响十分明显，在一定培养时间内，这种影响随时间的延长而增强。
4 讨论
多糖具有广泛的生物学活性〔9〕，将多糖作为抗肿瘤药物，可以克服肿瘤病人化疗和放疗过程中在杀死肿瘤细胞的同时造成的对机体正常细胞的损伤。尤其多糖与一些抗癌药如5-FU、环磷酰胺等合用，可恢复由化疗所导致的免疫功能低下，增强抗肿瘤的作用〔10〕。加上多糖的其它特征，如可作免疫调节剂，毒副作用少，来源广等〔9〕，多糖在肿瘤治疗上具较广的应用前景〔10〕。本文运用半固体琼脂培养法和MTT法研究了极大螺旋藻多糖对血癌细胞U937和HL-60的影响，该多糖对U937细胞的生长有明显促进作用，60和15 nmol/L浓度组的作用尤其明显，从表1、2可以看出，该多糖对U937的促进作用具时效性，第10日作用最明显。
极大螺旋藻多糖对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用。从表3、4可以看出，该多糖对HL-60的抑制也具有浓度效应和时间效应，60和15 nmol/L浓度组的抑制作用非常明显。另外从时间上来看，该多糖对HL-60细胞的抑制作用在第10日前随培养时间延长而增强，至第10日这种作用达到最强，随后这种抑制作用逐渐减弱。
至于极大螺旋藻胞内多糖促进U937细胞生长及抑制HL-60生长的机制，目前还不十分清楚。有文献报道，多糖的抗肿瘤作用与其诱导大分子合成有关，尤其与诱生细胞因子有密切的关系〔9〕，多糖抑制癌细胞增殖的分子机制主要是通过抑制DNA的合成起作用的〔6〕。螺旋藻多糖因不能损伤癌细胞的复制模板而不能直接杀伤癌细胞，其对移植肿瘤的抑制机制主要属于代谢性抑制，随多糖的除去，肿瘤DNA合成速率会逐渐恢复〔7〕。极大螺旋藻多糖对HL-60的抑制具有时效性，结果与报道相一致。极大螺旋藻具体通过何种机制来抑制HL-60细胞生长而促进U937细胞的生长，还有待于进一步研究。
*Address:Liu Yufeng ,Medical College of Nanjing University,Nanjing作者简介：刘宇峰 34岁，1986年南京大学生物系本科毕业，1991年南京大学生物系研究生毕业，获硕士学位。1991年至今任南京大学医学院讲师。专业研究方向为细胞和分子生物学及肿瘤免疫学。近年来主要从事螺旋藻蛋白及多糖对小鼠免疫功能及人肿瘤细胞生长影响的研究，已在《中国海洋药物》发表论文1篇（嗜盐隐杆藻胞外多糠对小鼠免疫功能的影响）。
参 考 文 献
[1] 王克夷.生命的化学，1994，14(5)：4
[2] 王维通.生物工程进展，1993，13(6)：30
[3] 刘力生，等.海洋科学，1991，6：44
[4] 庞启深，等.遗传学报，1988，15(5)：374
[5] Pang Q H， et al.Toxicology Letters,1989,48:165
[6] 刘力生，等.海洋科学，1991，5：33
[7] 方福德，等.现代医学实验技巧全书.北京：北医大、协和医科大联合出版，1995：446
[8] Morten B H,et al.J Immunol methods,1989,119:302
[9] 周世文，等.中国生化药物杂志，1994，15(2)：143
[10] 田庚元，等.化学进展，1994，6(2)：1114
(1998-02-03收稿)
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