急性白血病MDR₁与分化抗原关系及其临床意义

临床血液学杂志 2000年第6期第13卷 临床研究

作者：张晓晖　乔振华　杨林花　宋善俊

单位：张晓晖　乔振华　杨林花(山西医科大学第二医院血液科 太原，030001)；宋善俊(同济医科大学附属协和医院血液科)

关键词：急性白血病；多药耐药；细胞分化抗原

　　摘要　目的：探讨急性白血病MDR₁⁺/CD₃₄⁺表型的临床意义。方法：采用流式细胞仪及对碘硝基四唑盐(INT)细胞毒检测法，分析了51例初治及17例复发急性白血病患者细胞的表面分化抗原及MDR₁⁺基因编码的p170阳性率，并用INT法的体外药敏试验进行对照。结果：MDR₁⁺与CD₃₄⁺有显著相关性(r=0.842，P＜0.01)，而与CD₁₃、CD₁₄、CD₁₅、CD₃₃、HLA-DR等其它髓系抗原无关；MDR₁⁺/CD₃₄⁺表型细胞较MDR₁^-/CD₃₄^-表型细胞缓解率、生存期、缓解期显著缩短。结论：急性白血病MDR₁⁺/CD₃₄⁺表型可作为白血病预后不良的指标。

Study on the differental antigen relation with MDR₁

　　and their clinical significance in acute leukemia

ZHANG Xiao-hui　QIAO Zhen-hua　YANG Lin-hua

　　(Department of Hematology of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001)

　　SONG Shan-jun

　　(Institute of Hematology,Union Hospital,Tongji Medical University)

　　Abstract　Objective:To detect the expression of the multidrug resistance(MDR) gene product(P-glycoprotein) and differential antigen, clinical significance of MDR₁⁺/CD₃₄⁺ phenotype in the patients with acute leukemia.Method:By means of flow cytometry(FCM) and P-iodonitrtetrazolium violet(INT) method, 51 cases and 17 cases were studied including,previously untreated group and relapse group,respectively.Result:The results showed the MDR₁⁺ phenotype correlated with CD₃₄⁺ phenoype in acute leukemia(r=0.842,P＜0.01);In the resistance drug group,the ratio of the expression of CD₃₄⁺ and MDR₁⁺ was higher than that of sensitivity group(P＜0.01，P＜0.05),There were no correlations among MDR₁⁺ and CD₁₃、CD₁₄、CD₁₅、CD₃₃ HLA-DR;The ratio of CR and the time of disease free surival (DFS) with the MDR₁⁺/CD₃₄⁺ phenotgpe was significantly less than those of the MDR₁^-/CD₃₄^- phenotype.Conclusion:The MDR₁⁺/CD₃₄⁺ phenotype is a poor factor in the prognosis of patients with acute leukemia.

　　Key words　Acute leukemia　Multidrug resistance　Differential antigen

　　白血病细胞多药耐药(MDR)是白血病治疗失败的主要原因，是临床治疗白血病所面临的棘手问题，其耐药机制的阐明，对化疗将会产生深远的影响。以往研究CD₃₄⁺或MDR₁⁺分别与临床疗效的关系较多；而对白血病细胞MDR₁⁺表达与细胞表面分化抗原的关系报道少见，这两者之间的关系与白血病缓解和预后等的相关性，国内外报告结果尚不完全一致。本研究分析急性髓性白血病细胞MDR₁⁺与表面分化抗原的关系，旨在对其临床意义进行探讨。

　　1　资料与方法

　　1.1　临床资料

　　根据FAB协作组诊断标准，确诊68例急性髓性白血病患者，男41例，女27例；中位年龄41(15～69)岁。初治51例，复发17例。FAB分型：M₁9例，M₂10例，M₃6例，M₄14例，M₅18例，M₆5例，

　　本课题由山西省自然科学基金资助(No.92043)M₇1例，慢性粒细胞急性粒细胞变5例。对照组为11例正常人，男6例，女5例；中位年龄37(14～51)岁。患者确诊后采用DA，个别采用HA、HAD、AA等化疗方案进行治疗。

　　1.2　检测方法

　　MDR₁基因编码p170的阳性率＞20%为MDR₁⁺，CD₃₄阳性率＞20%为CD₃₄⁺。CD₁₃、CD₁₄、CD₁₅、CD₃₃及HLA-DR单抗均购自美国DOKO公司，对碘硝基四唑盐(INT)由瑞士FLUKO公司提供。

　　单个核细胞制备：髂后上棘抽取骨髓液3 ml置于肝素抗凝标本中，缓缓注入淋巴细胞分离液上，密度梯度离心20 min(2 000 r/min)，吸取界面上单个核细胞层(MNC)，用PRMI-1640洗涤3次，2%多聚甲醛固定。

　　药物工作液的配制：药物用PRMI-1640培养基配制成4 x溶液，-20℃贮藏，时间不超过2周。药物浓度参考临床化疗药物血浆浓度峰值。用Limberg公式计算血浆药物浓度，作为体外药物浓度的依据。足叶乙甙(VP 16)40 g/L，阿糖胞苷(Ara-c)80 g/L，三尖彬酯碱(H)1 g/L，柔红霉素(DNR)25 g/L，长春新碱(VCR)4 g/L，阿霉素(Adr)64 g/L。

　　INT药敏检测：参考Bernabei等和Santini等方法稍作改进。将单个核细胞液加入96孔平底培养板中，100 μl/孔每组做4个平行孔，按设计分组分别加入不同的药物、等量PRMI 1640及含20%胎牛血清的培养液，5%CO₂37℃培养72 h后，加40 μl的INT溶液(1 g/L)继续孵育12 h，加入1 mol/L的HCl 20 μl。用DG 3022型酶联免疫检测仪，检测在490 nm波长的光密度A值，4孔取平均值计算细胞毒性指数CI〔CI=(1-实验组A值/对照组A值)×100%〕。CI≥30%为体外敏感，CI＜30%为体外耐药。

　　白血病细胞表面分化抗原及p170样品制备：采用间接免疫荧光标记法，以1×10⁶/ml分7组细胞，缓冲液(PBS)洗涤2次，每次2 min(1 000 r/min)。弃上清液，分别加入1∶200稀释的CD₁₃、CD₁₄、CD₁₅、CD₃₃、CD₃₄、HLA-DR、p170单抗各100 μl，均水浴30 min(37℃)，用PBS液洗涤2次。弃上清液后，均加入1∶200稀释的羊抗鼠异硫氰酸荧光素FITC(DAKO，USA)100 μl，经500目筛网过滤即可上机检测。除设有正常对照组外，还设有PBS代替相应单抗的阳性对照，只加入相应单抗的阳性对照，只加入FITC-IgG抗体的阳性对照。

　　流式细胞仪检测：采用FACS 420型流式细胞仪，激光光源为2 W氢离子激光器，输出功率300 mW，激发波长为488 nm。由于FITC和溴化乙啶(EB)两种荧光染料具有相同的激发谱线，FITC发绿色荧光，以520 nm带通滤片，EB发出红色荧光，以590 nm的长通滤片用于荧光检测。测量数据和图像送入HP-300 Comsort 30计算机，用相应的程序软件进行资料处理。

　　1.3　统计学处理

　　采用t检验，χ² 检验及相关分析。

　　2　结果

　　2.1　药敏试验与p170、CD₃₄阳性率的关系

　　本研究结果显示常用6种化疗药物体外药敏与临床疗效总的符合率为81.2%，敏感性为83.7%，特异性为74.7%。该方法可靠，有良好的临床符合率。Ara-C、H、DNR、VP₁₆、VCR及ADR体外耐药组和敏感组的CD₃₄⁺、MDR₁⁺差异有显著性意义，耐药组两者表达率均高于敏感组(P＜0.01或P＜0.05)，见表1。初治组、复发组、对照组的白细胞p170与CD₃₄抗原的表达阳性率见表2。p170与CD₁₃、CD₁₄、CD₁₅、CD₃₃、HLA-DR均无相关性。

表1　两组6种化疗药物体外的CD₃₄⁺和MDR₁⁺的表达率

　　与敏感组比较¹⁾P＜0.05，²⁾P＜0.01

表2　白血病细胞p170与CD₃₄抗原的表达阳性率%

　　p170与CD₃₄表达的相关系数r=0.842,P＜0.01与对照组比较¹⁾P＜0.05，与复发组比较²⁾P＜0.05

2.2　白血病细胞MDR₁⁺表达率与表面分化抗原的关系

　　AML细胞MDR₁⁺与CD₃₄⁺显著相关(相关系数r=0.842,P＜0.01)；MDR₁⁺/CD₃₄⁺共表达16例形成MDR₁⁺/CD₃₄⁺表型。而MDR₁⁺与CD₁₃、CD₁₄、CD₁₅、CD₃₃、HLA-DR均无关。

　　2.3　急性白血病MDR₁和(或)CD₃₄不同组别缓解率及两年生存率比较

　　CD₃₄⁺、CD₃₄^-两组患者的缓解率分别为34.2%和76.7%，差异有极显著性意义(P＜0.01)；而CD₃₄⁺2年生存率组显著低于CD₃₄^-组(P＜0.01)；MDR₁⁺组的缓解率(31.0%)和2年生存率(17.2%)均显著低于MDR₁^-组的69.2%和43.6%(均P＜0.01)；MDR₁/CD₃₄各组缓解率及生存率比较差异有极显著性意义(均P＜0.01)。其中MDR₁⁺/CD₃₄⁺缓解率(18.8%)和生存率(6.3%)低于MDR₁^-/CD₃₄^-组的100%和70.6%(均P＜0.05)；MDR₁^-/CD₃₄^-组的缓解率和生存率高于MDR₁⁺/CD₃₄^-组46.2%和30.8%。见表3。

　　3　讨论

　　MDR是白血病治疗失败的主要原因。研究其生物学特性及发生机制，从而进一步探讨逆转耐药的途径，是国内外学者研究的热点课题。CD₃₄抗原是一阶段特异性而非系特异性的白血病分化抗原^〔1〕，在白血病细胞CD₃₄抗原表达明显增加；MDR₁基因编码p170是白血病细胞膜上溢出泵，能将进入细胞内的结构、功能不同的药物泵出细胞，使细胞内的药物浓度降低，从而使白血病细胞避免被药物杀死。

表3　急性白血病不同组别缓解率及2年生存率比较%

　　组间比较，均P＜0.01　　本研究中6种化疗药物耐药组p170、CD₃₄阳性率表达高于敏感组。Thomas等^〔2〕和Campos等^〔3〕亦有类似的报道。提示两者均与临床耐药有关。以往人们研究较多的是MDR₁⁺及CD₃₄⁺各自在复发及难治表达，而对于MDR₁⁺与表面分化抗原的关系报道少见。本文资料显示，MDR₁⁺与CD₃₄⁺显著相关，而与其余髓系抗原CD₁₃、CD₁₄、CD₁₅、CD₃₃、HLA-DR无关，与国外报道一致^〔4〕。其中MDR₁⁺/CD₃₄⁺表型对化疗反应差，其缓解率明显低于MDR₁^-与CD₃₄^-患者。本研究结果与国内、外研究结果一致^〔2，5〕。目前认为，多能干细胞某些特征与MDR₁⁺/CD₃₄⁺共表达的细胞特征相近^〔6〕，且多是一些分化差的细胞。Campos等指出，150例AML患者MDR₁⁺/CD₃₄⁺共表达50例；CD₃₄^-/MDR₁^-46例，MDR₁⁺/CD₃₄⁺缓解率9/50，CD₃₄^-/MDR₁^-缓解率45/46，差异显著，且MDR₁⁺/CD₃₄⁺生存期及缓解期均下降；MDR₁⁺/CD₃₄⁺表型可作为白血病预后差的指标。本研究亦发现16例MDR₁⁺/CD₃₄⁺AML患者中，仅有3例经长期大剂量强烈化疗达完全缓解，而MDR₁^-/CD₃₄^-17例全部存活，至今无一例复发。总之，MDR₁⁺/CD₃₄⁺表型的发现，一则为我们研究白血病细胞耐药机制提供新思路，二则可以作为AML患者预后预测的重要指标。

　　参考文献

　　1，Civine I,Strauss L C,Brovall C,et al.Analysis of hematopoiesis a hematopietic progenitor cell surface antiger detined by a monoclonal antibody raised agaist KG-Ia cell.J Immunol,1984,133:157～161

　　2，Thomas X,Campos L,Archimbaud E,et al.Surface marker expression in AML at first replase.Br J Haematol,1992,81:80～88

　　3，Campos L,Guyotat D,Archimbaud E,et al.Clinical siginifcance of multidrug resistance P-glycoprotein expression on acute nonlymphoblastic leukemia cells at diagnosis.Blood,1992,79:473～479

　　4，Drach D,Zhao S,Drach J,et al.Subpopulations of normal peripheral blood and bone marrow cells express a functional multidrug resistance phenotype.Blood,1992,8:2729～2736

　　5，高秀华，张晓晖，乔振华，等.难治与复发急性白血病p170和p26与多药耐药关系的分析.中华血液学杂志，1998，19：67～69

　　6，Chaudharg P M,Roninson I B.Expression and activity of P-glycoprotein,a multidrug errlux pump in human hematopoietic stem cells.Cell,1991,66:85～92

(收稿 2000-03-29)