PML/RARa融合基因检测在早幼粒细胞白血病鉴别诊断中的意义

临床血液学杂志 2000年第3期第13卷 研究报告

作者：汪健　孙自敏　何晓东　徐修才　吴竞生

单位：汪健　（安徽省立医院中心实验室　合肥，230001）；孙自敏　（安徽省立医院中心实验室　合肥，230001）；何晓东　（安徽省立医院中心实验室　合肥，230001）；徐修才　（安徽省立医院中心实验室　合肥，230001）；吴竞生　（安徽省立医院中心实验室　合肥，230001）

　　急性早幼粒细胞白血病（APL），具有特异性的染色体易位t（15∶17）及PML/RARa融合基因。在细胞遗传学(MIC)分型的基础上，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术，检测APL的PML/RARa融合基因的mRNA，可以用来诊断或鉴别诊断，同时也可以进行微量残留白血病细胞（MRLC）的检测。

　　1　材料与方法

　　1.1　病例

　　例1、2为经外院诊断和治疗后转入我院的患者，例3～9为门诊或住院的患者，经FAB分型不能完全确诊，例10、11是同一例初诊与完全缓解26个月的M₃患者，例12、13是同一例完全缓解8个月与32个月患者。13例次中，男4例，女9例，年龄17～68(中位年龄36.5)岁。

　　1.2　方法

　　细胞遗传学：将骨髓细胞24 h短期培养，常规裂解、预固定、固定、制片、烤片、G显带处理，分析20个以上中期分裂相，核型分析根据染色体国际命名法（ISCN 1985）。

　　免疫分型：所用单抗包括B淋巴系的CD10、CD19、CD22，T淋巴系的CD2、CD3、CD5、CD7，髓系的CD9、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33，造血干/祖细胞的CD34，以及组织相容性抗原HLA-DR。二抗为标记异硫氰酸荧光素（FITC）的兔抗鼠IgG。所有试剂均购自中国科学院天津血液病研究所。阳性判断标准：荧光阳性细胞＞30%。

　　RNA提取：肝素抗凝的骨髓或外周血细胞，用淋巴细胞分离液分出单个核细胞，细胞洗涤计数后加入含10%DMSO保存液（100 ml/L小牛血清的IMDM），混匀后置-80 ℃冰箱保存，临用前取出，用TRIZOL RNA试剂盒提取。测定吸光度(A)值，并要求A₂₆₀/A₂₈₀＞1.6。

　　筑巢式RT-PCR检测APL的PML/RARa mRNA 寡核苷酸引物由瑞金医院上海血液学研究所提供。

　　逆转录反应：40 μl体系中包括1 μg RNA，QRT 100 ng，RNAsin 40 U，200 U M-MLV，0.01 mmol DTT，20 mmol dNTP，37 ℃孵育1 h，4 ℃备用。

　　PCR反应：PCR反应分两个体系进行。第一体系检测L型，第一步PCR引物PCR1+PCR6，第二步PCR引物PCR2+PCR5；第二体系检测S型，第一步PCR引物PCR1+PCR3，第二步PCR引物PCR2+PCR4。反应体系100 μl，第一步反应包括逆转录产物10 μl，引物150 ng，20 mmol dNTP，Taq酶1.5 U；第二步扩增反应用10 μl第一步扩增产物进行扩增，4℃冰箱备用。

　　产物鉴定：10 μl PCR扩增产物，20 g/L琼脂糖电泳，溴乙啶染色，紫外灯观察结果。

　　2　结果

　　9例经形态学、免疫分型及MIC分型或者缺乏初诊资料不能完全确诊的患者中，5例PML/RARa融合基因阳性，另4例综合MIC分型结果与融合基因的结果，分别诊断为MDS、CML、M2、M2复发。APL长期完全缓解的例10患者PML/RARa融合基因消失。长期缓解的例12患者，虽然细胞遗传学未见异常，但PML/RARa融合基因仍然存在。结果见表1。

　　L：长型，　S：短型；　CR：完全缓解；　ATRA：全反式维甲酸

　　3　讨论

　　骨髓细胞形态学迄今仍是白血病分型最基本的依据，但单纯形态学检测的诊断率只能达85%左右，特别是经过治疗后的患者，形态学则完全不能够确诊。由于髓系白血病细胞表达多种分化抗原，且与正常血细胞存在多种抗原的交叉表达，因此免疫分型不能特异识别白血病克隆，目前尚未发现有针对于白血病各亚型的特异标志，免疫分型对确诊早幼粒细胞白血病意义不大。细胞遗传学虽然有重要的鉴别诊断和预后意义，但由于受到细胞数以及化疗药物的影响，加之原红细胞正常分裂相掩盖等原因，使其受到一定的限制。

　　APL患者90%以上具有特异的t（15；17）（q21；q12-21）染色体易位。17号染色体维甲酸受体a（RARa）基因和15号染色体上的早幼粒细胞白血病基因（PML）发生交互易位。17号染色体断裂点恒定地位于RARa基因的一个17 kb的内含子2中，而15号染色体断裂点位于PML基因两个断裂点集中区域内，结果产生L和S两种不同长度的PML/RARa融合基因转录本，经RT-PCR扩增分别产生151 bp与163 bp大小的核苷酸片段。RT-PCR技术具有敏感度高、特异性好的特点，即使染色体分析无明显异常核型也能检出分子异常，特别是临床缓解的患者，细胞遗传学分析无异常，通过基因检测的方法，可以进行MRLC检测。因此通过APL融合基因PML/RARa mRNA检测，可以鉴别诊断难以确诊的病例以及MRLC的检测，以便临床选择可行的治疗方案、预后判断以及疗效观察。

收稿：1999-07-06