流式细胞仪双标法分析白血病相关复合物及预后价值

临床血液学杂志 2000年第2期第13卷 研究报告

作者：于桂芬　殷晓华　程美兰　胡赛鹏　张泽国　尉达民　王良绪

单位：于桂芬(牡丹江市血液病研究所、北方血液病医院　牡丹江，157003)；殷晓华(牡丹江市红旗医院)；程美兰(牡丹江市血液病研究所、北方血液病医院　牡丹江，157003)；胡赛鹏(牡丹江市血液病研究所、北方血液病医院　牡丹江，157003)；张泽国(牡丹江市血液病研究所、北方血液病医院　牡丹江，157003)；尉达民(北京医科大学第三临床医学院)；王良绪(北京医科大学第三临床医学院)

　　应用流式细胞仪免疫荧光双标法检测18例急性白血病(AL)，对照11例骨髓单个核细胞(MNC)或外周血干细胞移植术(PBSCT)时采集的外周血干细胞(PBSCS)的白血病相关复合物表达情况〔其中急性髓细胞白血病(AML)以CD₃₄/CD₅₆复合物为标志，急性淋巴细胞白血病(ALL)及急性未分化细胞白血病(AUL)以CD₃₄/CD₅₆，CD₁₉/CD₃₄，CD₁₉/CD₃₃，CD₁₉/CD₅₆复合物为标志探讨这些白血病相关复合物对AL的预后价值。

　　1　病例和方法

　　1.1　病例来源

　　18例AL患者包括AML 15例(M₂8例，M₃7例)，ALL-L₂2例，AUL 1例。男6例，女12例。年龄18～60岁。采集标本28份，其中2份来自PBSCT时采集之PBSCS，26份为骨髓标本。对照组取自非白血病(NL)患者的骨髓标本，共采标本11份(大致正常4例，小细胞低色素性贫血4例，巨幼红细胞贫血1例，原发性血小板减少性紫癜2例)。男7例，女4例。年龄29～69岁。AML以DA方案(柔红霉素、阿糖胞苷)化疗，ALL、AUL以DVCP方案(柔红霉素、长春新碱、环磷酰胺、泼尼松)化疗。其中6例为PBSCT术者。疗效判断依据1987年全国白血病化疗讨论会制定的标准。

　　1.2　抗原标志

　　无菌操作取抗凝骨髓或PBSCT术时采集之PBSCS 1～3 ml，分离MNC。取1×10⁶ MNC分装于50 μl小离心管内，离心(5 000 r/min×30 s)，弃上清。根据待检免疫复合物配对，分别于相应小离心管内加入相应直标单克隆抗体，其中CD^-₃₄FITC、CD^-₅₆PE、CD^-₁₉cychrome(美国Pharmigen公司)各20 μl，CD^-₃₃PE(美国BD公司)10 μl，加毕后轻轻振荡混匀，置冰箱4℃30 min后取出，PBS洗液清洗2次后，加保存液1 ml，4℃冰箱保存待上机。对照组标本以同样方法制备。

　　1.3　流式细胞仪双荧光法分析膜抗原标志

　　采用FACS can流式细胞仪(BD公司)分析，FACS激光功率15 mv，激发光波长488 nm，第1荧光探测器收集通过530 nm带滤光片的绿色荧光(FL₁)，第2荧光探测器收集通过586 nm带滤光片的橙色荧光(FL₂)、第3荧光探测器收集通过620 nm带滤光片的红色荧光(FL₃)，分别反映FITC、PE及cychrome的荧光强度。用Autocomp软件结合CALIBRITE Beads检正仪器，采用LYSIS Ⅱ软件分析，每次读取10 000个细胞。

　　1.4　统计学处理

　　采用F检验、Q检验或秩和检验。

　　2　结果

　　2.1　对照组、完全缓解(CR)组AL白血病相关复合物的检测结果

　　动态观察18例AL患者，13例CR者，5例患者复发或死亡。11例对照CD⁺₁₉/CD⁺₃₄、CD⁺₁₉/CD⁺₅₆、CD⁺₁₉/CD⁺₃₃检测结果见表1。对照组及CR组(包括化疗CR组及PBSCT CR组)CD⁺₃₄/CD⁺₅₆复合物及CD⁺₃₄单阳细胞检测结果及统计学分析结果见表2。

表1　11例对照检测结果　　，%

　　表2　对照组、化疗CR组、PBSCT CR组CD⁺₃₄/CD⁺₅₆、CD⁺₃₄检测结果　　，%

　　由表1可见，CD⁺₁₉/CD⁺₅₆、CD⁺₁₉/CD⁺₃₃、CD⁺₁₉/CD⁺₃₄于对照组中表达率很低，各组gate值均＜1.0%，total值均＜0.5%。表2可见，CD⁺₃₄/CD⁺₅₆表达率于对照组、化疗CR组、PBSCT CR组gate值＜0.5%，total值＜0.1%。CD⁺₃₄单阳细胞表达率于各组gate值＜2.5%，total值＜0.5%。各组CD⁺₃₄/CD⁺₅₆及CD⁺₃₄表达率差异无统计学意义。

　　2.2　复发或死亡患者白血病相关复合物检测结果

　　5例临床预后差的患者及1例PBSCT术后CR患者，白血病相关复合物检测结果及相关临床资料见表3。①CD⁺₃₄/CD⁺₅₆复合物：1，2为M₂患者，检出有CD⁺₃₄/CD⁺₅₆高表达，较对照gate值及total值均升高＞10倍，其中例1 gate值升高＞130倍，total值升高＞239倍。此2例患者化疗均不敏感。例1诊断后3个月死亡，例2复发后多次化疗均未缓解。例3，4分别为AUL、ALL-L₂患者，其CD⁺₃₄/CD⁺₅₆表达率较对照无明显升高。例5，6为PBSCT术者，其PBSCS CD⁺₃₄/CD⁺₅₆表达率亦无明显升高。②CD⁺₃₄单阳细胞：例2，3，4，5，6均检出CD⁺₃₄单阳细胞高表达，gate值升高＞1.3倍，total值升高＞8倍，其中例5，6标本来自PBSCS。此5例患者前4例复发或复发后持续未缓解，例6仍CR。③CD⁺₁₉/CD⁺₃₃，CD⁺₁₉/CD⁺₅₆，CD⁺₁₉/CD⁺₃₄复合物：例3复发状态、例4 CR状态时，检测骨髓细胞CD⁺₁₉/CD⁺₃₃，CD⁺₁₉/CD⁺₅₆，CD⁺₁₉/CD⁺₃₄表达率升高，较对照gate值分别升高＞3，9，6倍，total值分别升高＞5，18，15倍，检测3个月后，例4复发，例3复发后多次化疗均未缓解。例5 PBSCS检出有CD⁺₁₉/CD⁺₃₃高表达，较对照gate值升高69倍，total值升高76倍。PBSCT术后3个月的患者复发。

表3　白血病临床资料及相关复合物测定结果　　%

　　3　讨论

　　3.1　CD⁺₃₄/CD⁺₅₆复合物

　　文献报道，CD⁺₃₄/CD⁺₅₆复合物多见于伴有t(8；21)(q22；q22)染色体易位的AML患者，儿童20%可检出，对CD⁺₃₄/CD⁺₅₆阳性AML，尤其是M₂有明显预后提示价值。本文检测18例AL患者有该复合物，得出类似结论。AML M₂患者无论初发或复发状态，一旦检出CD⁺₃₄/CD⁺₅₆高表达，则对化疗不敏感，预后差，患者1，2即如此。从本文检测结果看，CD⁺₃₄/CD⁺₅₆复合物对AUL、ALL-L₂预后价值不大。

　　3.2　CD⁺₃₄单阳细胞

　　例2，3，4复发或CR状态时，检测骨髓细胞均有CD⁺₃₄细胞高表达，此3例患者均表现为化疗不敏感或CR者3个月内复发。因此认为，无论AML还是AUL、ALL-L₂患者，一旦骨髓细胞检出CD⁺₃₄单阳细胞高表达，则化疗不敏感，短期内复发。原因与该类细胞存在PgP高表达(MDR高表达)有关。

　　3.3　CD⁺₁₉/CD⁺₅₆，CD⁺₁₉/CD⁺₃₃，CD⁺₁₉/CD⁺₃₄复合物

　　11例对照此3种复合物表达率很低，gate值＜1.0%，total值＜0.5%，即正常人或造血系统非恶性疾患骨髓内此类细胞存在微量，这与国外报道一致。国外报道，CD⁺₁₉/CD⁺₅₆、CD⁺₁₉/CD⁺₃₃、CD⁺₁₉/CD⁺₃₄高表达，对ALL有明显预后价值。例3复发状态、例4 CR状态时，检出此三种复合物高表达，3个月后例4复发，例3多次化疗均未缓解，表明患者体内存在多个白血病细胞亚群，白血病细胞分布异质性大，化疗不敏感，预后差。与其他报道一致。

　　3.4　PBSCS的评价

　　患者5，6为2例PBSCT术者，对其PBSCS进行了分析。结果例5 PBSCS检出有CD⁺₁₉/CD⁺₃₃明显高表达，例6检测CD⁺₃₄/CD⁺₅₆表达率无明显升高，PBSCT术后3个月，例5复发，例6仍CR。表明例5 PBSCS内有大量CD⁺₁₉/CD⁺₃₃白血病细胞存在，因此回输后很快复发。这与其他报道类似。这2例患者PBSCS均检出CD⁺₃₄单阳细胞高表达，PBSCT术者应用氟美松、G-CSF、化疗等动员措施后，外周血CD⁺₃₄单阳细胞升高。而CD⁺₃₄单阳细胞对PBSCS的预后评价作用，有待进一步探讨。■

(收稿日期：1998-10-23)