端粒酶活性与白血病细胞系的分化

　　中国肿瘤临床1999年第22卷第3期

张莉萍　蒋纪恺　刘小珊　张彦　许湘儒　刘北忠　何渝军　刘祥贵　康格非

　　 摘要　目的：为了探讨白血病细胞的分化和端粒酶活性改变的关系。方法：采用PCR－ELISA方法检测白血病细胞株K－562和HL－60诱导分化前后的端粒酶活性。结果：未经药物处理的K－562和HL－60细胞有高的端粒酶活性；用苦参碱作用K－562细胞和维甲酸处理HL－60细胞一定时间后，端粒酶活性被明显抑制；分化诱导剂不能直接抑制端粒酶活性；端粒酶活性的高低与细胞所处的分化状态有关。结论：分化是细胞自身调控的过程，端粒酶活性的高低与细胞所处的分化状态密切相关。

　　关键词：端粒酶活性白血病细胞系PCR－ELISA

　　端粒酶作为当今肿瘤学研究的一大主题引起了学者们的广泛关注。有大量文献报道肿瘤细胞能通过某些机制使端粒酶的表达再活化，85％肿瘤患者都有端粒酶的过度表达。提出端粒酶是肿瘤细胞增殖的指标。在人类它可以存在于胚胎、成人睾丸和卵巢滤泡以及人体某些组织中，但处于非常低的水平^[1]。在绝大多数体细胞中该酶不表达或受到抑制^[2]。这些发现提示端粒酶在胚系细胞中活化，在极少的体细胞中具有高的增殖潜能。因此推测分化细胞的端粒酶活性可能被抑制或丢失^[3]。

　　为了进一步了解端粒酶的功能，以求阐明端粒酶在细胞基因复制中的作用以及作为抗肿瘤潜在靶点的作用机制，我们以红白血病K－562细胞株和白血病HL－60细胞株为实验模型，分析了增殖的白血病细胞诱导分化后端粒酶活性的改变及其机制，结果表明细胞分化的同时伴随着端粒酶活性的降低。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞培养

　　人红白血病细胞株K－562和人白血病细胞HL－60细胞株，采用常规培养，培养液为含10％小牛血清，青、链霉素各100U/ml的RPMI－1640，在37℃，饱和湿度，5％CO₂孵箱中培养，每3～4天换液传代培养。

　　1.2　药品和试剂

　　苦参碱（Matrine），自备。全反式维甲酸（all－transretinoicacid，ATRA，由重庆华邦制药有限公司提供），用无水乙醇配成10^－2mol/L储液，置－20℃冰箱保存，使用前用生理盐水稀释成所需浓度。RNaseA和端粒酶测定试剂均购自BOEHRINGERMANNHEIM公司。

　　1.3　端粒酶分析

　　制备端粒酶提取液：收集对数生长期细胞，调节细胞数为1×10⁵/ml，处理组加入苦参碱(0.1mg/ml)，置37℃，5％CO₂培养1～5天。收集细胞，调整细胞数为1×10⁶/ml，4℃，3000g，离心10分钟，弃去上清，用PBS重悬细胞，重复离心。弃去上清，加入200μl裂解剂(5％CHAPS)，冰浴30分钟，4℃，16000g，离心20分钟，小心移上清于用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的离心管。逆转录（端粒酶为自身携带RNA模板的逆转录酶）:50μl反应体系中包括2μl端粒酶提取液，dNTP，Taq酶，生物素标记的引物I(biotin－labeled－P1)和引物Ⅱ，25℃，30分钟；端粒酶灭活：94℃，5分钟；PCR扩增：94℃，30秒，50℃，30秒，72℃，90秒，循环次数30次；平衡：72℃，10分钟。扩增产物检测：5μl扩增产物，20μl变性试剂，室温下孵育10分钟，加入200μl杂交混合液，含地高辛标记的检测探针（DIG－labeledprobe），充分混匀，加100μl混合液于抗生物素蛋白包被的微孔板上。之后用与过氧化物酶结合的抗地高辛抗体（Anti－DIG－POD）检测经固定的PCR产物。最后加入过氧化物酶的代谢底物TMB便可产生一颜色反应产物。测定450nm和690nm的OD值。

　　1.4　诱导分化

　　K－562细胞用苦参碱（0.1mg/ml）处理1～5天，分化程度用联苯胺染色监测^[4]。HL－60细胞用ATRA(3)(1.0umol)处理1～5天，分化程度用NBT染色监测^[5]。

　　2　结果

　　2.1　用药组白血病细胞中端粒酶活性的变化

　　用苦参碱作用K－562细胞2天后，出现端粒酶活性的降低；5天后，则引起端粒酶活性的明显抑制（图1A），苦参碱作用后2天、5天联苯胺染色阳性率分别为4％、9％；同样，用ATRA处理HL－60细胞1～5天后，出现端粒酶活性的进行性降低（图1B），联苯胺染色阳性率分别为9％、56％、88％。这一结果提示端粒酶活性的抑制与细胞生长抑制、分化状态有关。

图1A　分化的K－562细胞中端粒酶活性的抑制

　　lysis:只有裂解液，无端粒酶提取液，作PCR阴性对照

　　rNaseA:用以灭活端粒酶的模板RNA，作自身对照

　　tSR8:含质控模板，作PCR阳性对照

图1B　分化的HL－60细胞中端粒酶活性的降低

　　lysis:只有裂解液，无端粒酶提取液，作PCR阴性对照

　　rNaseA:用以灭活端粒酶RNA模板，作自身对照

　　tSR8:含质控模板，作PCR阳性对照

　　2.2　分化诱导剂引起端粒酶活性的抑制是由细胞介导的

　　进一步探讨分化诱导剂引起端粒酶活性降低是直接抑制还是间接作用，以说明分化对端粒酶活性的影响，从而说明端粒酶在细胞增殖中的作用。用苦参碱作用K－562细胞5天后端粒酶活性明显抑制，而用苦参碱(0.1mg/ml)直接作用K－562细胞的提取液时发现端粒酶活性无明显改变，说明0.1mg/ml苦参碱对端粒酶活性无直接抑制作用。有文献报道ATRA对K－562细胞无分化作用，因此我们用ATRA(0.1umol,1.0umol)作用K－562细胞5天后，测定端粒酶活性；再用ATRA(0.1umol,1.0umol)处理未经任何诱导剂作用的K－562细胞提取液30分钟后，分析端粒酶活性，发现端粒酶活性均无明显改变（图2A）。提示分化诱导剂不能直接抑制端粒酶活性。

　　分化诱导剂不能直接抑制端粒酶活性，有否可能是细胞在分化时分泌的一种抑制分子（耐热或不耐热）直接抑制了端粒酶活性。在实验中，用ATRA诱导分化的HL－60细胞提取液（热灭活80℃10分钟或不灭活）和未经任何诱导剂作用的K－562细胞提取液直接作用30分钟后，分析端粒酶活性，结果显示端粒酶活性无明显改变，说明分化的HL－60细胞提取液不能明显抑制K－562细胞的端粒酶活性（图2）。提示分化的HL－60细胞中也不存在端粒酶的抑制分子。

图2　分化的HL－60细胞中不存在端粒酶的抑制分子

　　rNaseA:用以灭活端粒酶的RNA模板，作自身对照

　　1：2μlK－562细胞提取液和2μl热灭活的分化HL－60细胞提取液作用30分钟

　　2：2μlK－562细胞提取液和4μl热灭活的分化HL－60细胞提取液作用30分钟

　　3：2μlK－562细胞提取液和2μl分化的HL－60细胞提取液作用30分钟

　　4：2μlK－562细胞提取液和4μl分化的HL－60细胞提取液作用30分钟

　　3　讨论

　　我们用PCR－ELISA方法测定了白血病细胞株K－562和HL－60细胞中的端粒酶活性，结果显示K－562细胞和HL－60细胞有非常高的端粒酶活性，说明端粒酶在白血病细胞株中有强的表达。用苦参碱和维甲酸分别处理K－562、HL－60细胞一定时间后，K－562联苯胺染色阳性较对照组提高，形态趋向红细胞系分化^[6]，HL－60NBT染色阳性率提高，并向粒细胞系分化^[7]，本研究发现细胞分化的同时端粒酶活性明显降低。这些结果提示端粒酶活性与细胞的分化状态有关。目前还不清楚是分化诱导剂影响端粒酶基因的表达还是抑制了它的酶活性。

　　为了探讨细胞分化对端粒酶活性的影响，以求了解端粒酶在细胞增殖中的作用。在我们的实验中发现苦参碱作用K－562细胞5天后，端粒酶活性明显降低，而用苦参碱直接作用未经任何诱导剂处理的K－562细胞提取液后，分析发现端粒酶活性不被抑制；同样用ATRA直接作用K－562细胞提取液后端粒酶活性也无明显改变；分化细胞的提取液中也不存在端粒酶活性的抑制剂。所有这些结果都说明分化诱导剂引起端粒酶活性的抑制不是直接抑制，而是一个由细胞介导的调控过程。提示端粒酶活性的抑制是细胞分化所特有的，而不是生物化学的直接效应。在Bestilny等学者的实验中也证实了这一点^[8]。

　　有研究提示端粒酶抑制剂在抑制端粒酶活性的同时，伴有肿瘤细胞分化行为发生，提示端粒酶可能成为肿瘤治疗新靶点^[9]。为了明确端粒酶活性的抑制是细胞分化过程中所特有的，我们用RA作用K－562细胞5天后，端粒酶活性没有明显改变，说明没有发生分化的细胞，其端粒酶活性不降低；而用RA处理HL－60细胞3天后，在HL－60细胞分化的同时端粒酶活性很快降低，5天后端粒酶活性被明显抑制，说明随着细胞分化的日益成熟，端粒酶活性的降低程度更加明显。提示端粒酶活性与细胞所处的分化状态密切相关，因此可以推测在细胞分化的同时可能启动了端粒酶活性的抑制机制，可能伴有编码端粒酶RNA或蛋白亚单位的一个或几个基因转录受抑。由此也说明了端粒酶是肿瘤细胞增殖的指标。

　　ATRA诱导HL－60细胞向粒细胞系分化已为人们所认识，苦参碱作用K－562细胞后端粒酶活性下降，提示苦参碱对K－562细胞有诱导分化作用，但RA对K－562细胞无诱导分化作用在本研究中得到进一步证实。结果还说明肿瘤细胞被诱导分化后，其生化代谢途径发生改变的同时，细胞由增殖向分化途径逆转。

　　端粒酶作为一个肿瘤治疗的可能靶点，引起了学者们的广泛兴趣。尽管端粒酶活性与肿瘤有着因果关系，但至今仍缺乏确切的证据证明端粒酶抑制剂可有效地抑制肿瘤生长。本实验结果为研究端粒酶活性的调节提供了有价值的线索，将有助于证明这个抗瘤靶点的治疗潜能。

　　*本文课题受国家自然科学基金资助(39670881)

　　作者单位：刘祥贵　张莉萍　重庆医科大学第二临床学院（重庆市400010）

　　刘小珊　重庆医科大学第一临床学院

　　蒋纪恺　张彦　许湘儒　刘北忠　何渝军　刘祥贵　康格非　重庆医科大学临床生化教研室

　　参考文献

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　　2 Tahara H,Nakanishi T,Kitamoto M,et al.Telomerase activity inhuman liver tissues:comparison between chronic liver disease andhepatocellular carcinomas.Cancer Res,1995;55:2734

　　3 Albanell J,Han W,Mellado B,et al.Telomerase activity is repressed during differentiation of maturation－ sensitive but not resistant human tumor cell lines.Cancer Res,1996;56:1503

　　4 Tabilio A,Pelicci PG,Vinci G,et al.Myeloid and megakaryocytic properties of K－ 562 cell lines.Cancer Res,1983;43:4569

　　5 Sokoloski JA,Sartorelli AC,Rosen CA,et al.Normal functional of characteristics of cultured human promyelocytic leukemia cells (HL－ 60) after differentiation by dimethylsulfoxide.Blood,1990;82:625

　　6 Zhang LP,Jiang JK,Tam JWO,et al.Induction of differentiation of the human erythroleukemic cell line(K－ 562) by matrine.14th Asia Pacific Cancer Conference/4th Hong Kong International Cancer Congress,1997:86

　　7 Liu XS,Lou LS,Tam JWO,et al.Effects of arotinoid acid (R013－ 7410)on induction of apoptosis and differentiation,and telomerase activity,and cell cycle in HL－ 60 cell line.14th Asia Pacific Cancer Conference/4th Hong Kong International Cancer

　　congress,1997: 87

　　8 Bestilny LJ,Brown CB,Miuro Y,et al.Selective inhibition of telomerase during terminal differentiation of immortal cell lines.Cancer Res,1996;56:3796

　　9 Sharma HW,Sokoloski JA,Perez JR,et al.Differentiation of immortal cells inhibits telomerase activity.Proc Natl Sci Acad USA,1995;92:12343