移植物抗白血病作用
中华血液学杂志
CHINESE JOURNAL OF HEMATOLOGY
1999年第20卷第8期Vol.20No.8 1999
居小萍 王健民
关键词：移植物抗白血病(GVL) 降低复发
移植物抗白血病(GVL)作用对降低造血干细胞移植后的复发率起重要作用。异基因骨髓移植(allo－BMT)比自体骨髓移植(ABMT)复发率低的主要原因是ABMT缺乏GVL作用。外周血干细胞作为造血干细胞来源越来越多地用于临床并逐渐代替骨髓细胞，其原因之一为异基因外周血干细胞能增强GVL作用，而不加重急性移植物抗宿主病(GVHD)[1]。GVL最直接的证据为应用供体淋巴细胞输注(DLI)治疗慢性髓系白血病(CML)患者移植后的复发，其缓解率达70％[2]。越来越多的科研机构致力于GVL的研究并应用于临床。我们对研究现状作一综述。
1 GVL和GVHD的关系 40余年前Barnes和Loutit[3]就报道了不能用骨髓移植前大剂量放、化疗解释的GVL。文献[4]报道了2254例BMT病例，包括首次缓解期(CR1)的急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和首次慢性期(CP1)的CML，分4组：去T细胞移植未发生GVHD组，去T细胞移植合并GVHD组，非去T细胞移植组和供、受者基因型相同同胞移植组。结果表明，非去T细胞移植合并GVHD组的白血病复发率明显降低，非去T细胞移植不合并GVHD组比同基因同胞移植组复发率低，非去T细胞不合并GVHD组比去T细胞移植组复发率低。认为：①GVHD有抗白血病作用；②异基因移植物有不依赖于GVHD的抗白血病作用；③GVL可以不依赖于GVHD，但因T细胞去除而改变。
移植后的急、慢性GVHD均与复发率降低有关，并且GVHD越重，其复发的危险性越低。去除T细胞异基因骨髓移植后GVHD程度减轻而白血病复发率升高的事实说明，T细胞在GVHD抗白血病中起重要作用。从白血病类型分析，慢性GVHD对AML和CML有较强的抗白血病作用，而急性GVHD对ALL有较强的抗白血病作用[4]。Passweg等[5]研究了1132例ALL患者，CR1期BMT后合并GVHD患者的复发危险性：T系白血病为0.34，B系白血病0.44。CR2BMT时，T系白血病为0.54，B系白血病为0.61，均低于不合并GVHD者。这个结果证实，ALL移植后早期出现的GVHD有GVL作用，而且在T系和B系白血病中是相似的。
GVHD与GVL是可分的，BMT时输入T细胞数在107/kg以下时，一般不会产生GVHD；输注高剂量的T细胞有较强的抗白血病效应，但GVHD发生率也较高。已从行allo－BMT的CML患者培养出CD4＋抗白血病T细胞克隆[6]，而体外去除CD8＋T细胞、定量输入CD4＋T细胞的DLI能够有效地介导针对CML的GVL，达到再次诱导缓解的效果，而GVHD发生率较低[7]。在DLI的研究中，用基因转移技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因导入T细胞输入受者体内的疗法，既可保持T细胞的GVL作用，又可在GVHD发生时给予更昔洛韦从而选择性地将T细胞去除以控制或减轻GVHD[8]。最近的研究认为GVL可能先于GVHD出现。在应用去除CD8＋细胞的DLI治疗BMT后复发的病例中，GVL反应的证据常出现于GVHD之前，CML患者GVL反应的证据(包括白细胞减少、Ph＋细胞的降低)常出现于GVHD之前，在某些病例细胞遗传学应答常出现于GVHD前数周至数月。同样的现象也可见于多发性骨髓瘤患者，单克隆蛋白的减少常出现于GVHD之前。这种GVL先于GVHD出现的现象与以前报道的相反，其机制可能是GVL在体内产生于白血病特异性抗原或造血限制性特异抗原的应答，而此应答的产生早于非特异的反应如GVHD[7]。
2 GVL和细胞因子 在GVHD复杂的发病机制中，越来越多的研究资料证实其组织损伤的首要介质是失调分泌的细胞因子网络。即BMT预处理方案TBI和(或)化疗激活宿主细胞分泌高水平的炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TNF－α)、白细胞介素1(IL－1)和IL－6，炎性细胞因子直接地刺激T细胞或间接地通过提高抗原表达激活供者T细胞。激活的供者T细胞分泌数种细胞因子，其中IL－2和γ干扰素(IFN－γ)在急性GVHD发病中起关键作用，控制和放大对异体抗原的免疫应答，并刺激靶组织分泌多种炎性细胞因子，GVHD靶组织损伤与高水平的TNF－α和IL－1相关[9]。在用Rapamycin(RARP，一种细胞因子应答的抑制剂)预防GVHD时发现RARP抑制了Th1细胞的细胞因子的分泌，同时也抑制了DLI的GVL应答[10]，说明细胞因子在GVL中也起着重要作用。
在GVL中最早得到应用的是IL－2，体外研究发现，IL－2既能活化T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)，促进和增强其杀伤、溶解白血病细胞的功能，也可以诱导TNF、IFN－γ及巨噬细胞集落刺激因子(M－CSF)的释放，并与这些细胞因子相互作用发挥GVL作用。在小鼠MHC相合的异基因造血干细胞移植中，去除CD3＋T细胞后移植，GVHD相关死亡率降低，但复发率增高，当去除CD3＋的移植物与IL－2共培育，体外激活残存的NK细胞，GVL作用增强，复发率降低[11]。以B细胞白血病Balb/c小鼠为临床前模型，研究细胞因子介导的免疫治疗作用，结果表明ABMT后，可用IL－2诱导GVL作用，联合IL－2和IFN－γ有协同作用，能显著降低复发率，延长存活期。allo－BMT后复发，一部分单用DLI不能诱导缓解者联合应用DLI和小剂量IL－2可有效。该作者在ABMT治疗淋巴瘤及乳腺癌复发患者应用IL2激活的HLA相合DLI有效[12]。
IL－12是一个多效性的细胞因子，能刺激NK细胞增殖，促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导，还能诱导T细胞、NK细胞分泌IFN－γ，协同IL－2诱导LAK细胞的产生，促进Th0向Th1方向分化。小鼠实验证实，allo－BMT后当天注入4900U的IL－12显著抑制了急性GVHD，而GVL作用得到保存，IL－12的抗肿瘤活性依赖于CD8＋细胞而不依赖于NK细胞。在应用IFN－γ单抗后，这种抑制GVHD、保护GVL的作用均消失，证实IL－12诱导的IFN产物在IL－12的GVL中起重要作用[13]。另外，在应用人脐血(HUCB)作为造血干细胞来源时，其NK细胞的细胞毒作用低于成人外周血NK细胞(PLB－NK)，IL－2、IL－12能明显提高脐血NK细胞活性至与PLB－NK水平相似，增加穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶BmRNA的表达水平。提示外源性的细胞因子刺激能补偿脐血细胞不成熟的免疫，在免疫治疗中有潜在的应用价值[14]。
异基因CD8＋T细胞具有调节GVL和GVHD的作用，CD8＋T细胞可以根据细胞因子分泌进一步分类。Ⅰ类细胞(Tc1)分泌IL－2、IFN－γ；Ⅱ类细胞(Tc2)分泌IL－4、IL－5和IL－10。它们在体外分别由IL－12或IL4刺激而产生。Tc1能溶解异基因的靶细胞产生强的GVL作用，并且增加GVHD的发生，而Tc2调节GVL作用而不加重GVHD，提示这两类细胞均可促进异基因T细胞治疗白血病的作用。Tc2中IL－10水平的增加限制了其在allo－BMT中的应用，IL－10的分泌量与GVL的作用强度呈负相关[15，16]。
3 GVL的效应细胞 GVL的效应细胞大致可分为MHC限制性和MHC非限制性两种。MHC限制性的GVL效应细胞是CD3＋TCR＋的T细胞，其靶抗原可能是白血病相关抗原、白血病特异性抗原或肿瘤细胞表面的次要组织相容性抗原；MHC非限制性的GVL效应细胞是NK细胞和LAK细胞，这些大多数为CD3－TCR－细胞。GVL的效应细胞随模型的不同而不同，如在C57BL→A/J小鼠移植模型中，CD4＋细胞与GVHD相关，CD8＋细胞与GVL相关[13]。而另一个模型B6→B6C3F1中CD4＋Th1或CD8＋Tc1均可产生强的GVL作用，CD4＋Th2无此作用，并且体外细胞混合培养证实Th2抑制了Th1和Tc1介导的GVL作用，CD8＋Tc2也有GVL作用，但其作用因IL－10的分泌而受限[17]。大多数临床资料提示CD4＋细胞是GVL的重要效应细胞，BMT后，在某些患者体内可分离出对白血病具有直接溶细胞活性的CD4＋细胞。某些细胞株已被克隆，并被认定是CD3＋CD4＋TCR＋的细胞[6]。对于进行allo－BMT的白血病患者，从供者移植物中选择性地去除CD8＋细胞可降低GVHD的发病率及严重程度，而复发率无明显上升，提示GVL作用未受影响，尽管这一发现不能直接证实GVL作用由CD4＋细胞所致，但它提示CD8＋细胞在介导人类GVHD中最为重要[18]。小鼠实验证实，骨髓供者的NK细胞活性与GVL作用的强度相关，涉及不依赖GVHD的GVL作用，去除移植物中NK细胞则白血病的复发率增高[19]。BMT后患者外周血中NK细胞的数量和活性均增高，并且分离出的NK细胞在体外可溶解冰冻保存的宿主白血病细胞[20]，某些从BMT患者体内分离的NK细胞还对白血病祖细胞克隆增殖有抑制作用[21]。
GVL的分子机制目前所知甚少，其中对T细胞的活化已有所了解。例如，T细胞活化需要抗原呈递细胞(APC)，对细胞介导的GVL诱导敏感的白血病细胞必须有APC功能，CML细胞有APCs功能，这或许可以解释其对GVL诱导的独特敏感性。T细胞活化还需要与靶分子上各种粘附分子的相互作用。因此，粘附分子表达缺陷可能会使GVL作用降低，而其表达的恢复有助于增强GVL。例如，IFNα可使CML细胞LFA－3表达上升，由此提出了IFN－α可通过这一机制影响GVL的假说[22]。另外，T细胞的激活需要共刺激信号，例如B7∶CD28途径，肿瘤细胞表面缺乏B7可能会导致T细胞介导的GVL作用缺如[23]。
在比较外周血干细胞移植(PBSCT)和BMT的GVL活性时发现，外周血干细胞移植物的抗白血病作用强于骨髓移植物，其原因之一是人类外周血干细胞移植物所含的T细胞和NK细胞分别比骨髓移植物多10余倍和19～25倍，同时PBSCT的GVL活性增加不伴急性GVHD的加重，一个可能的解释为GVL和GVHD是随机的过程，如果供者GVHD反应的细胞数高于GVL反应的细胞数，骨髓移植物中相对“少”的淋巴细胞数可能已经包含了完全的GVHD潜能，收集外周血干细胞中的淋巴细胞数不会增加GVHD的效应细胞，但能导致丰富的GVL效应细胞[24]。但PBSCT后慢性GVHD增加，其原因尚待进一步研究。
4 ABMT中GVL作用的诱导 ABMT失败的主要原因是移植后原发病的复发，复发的原因与患者体内白血病细胞未能完全被根除关系更大，而不是移植物中肿瘤细胞的污染，与allo－BMT相比，复发率增加的原因可能是ABMT缺乏GVL作用。1989年Jones等[25]报道了ABMT后注入小剂量的环孢霉素A(CsA)可诱导出GVHD，这种GVHD局限于皮肤，既可以是急性的也可以是慢性的，临床呈自限性过程。GVHD与自体反应的T细胞产生有关，它识别MHCⅡ类抗原决定簇，调节体内的抗肿瘤活性。临床试验表明，ABMT后0～28天联合应用CsA和IFN－α能显著增强CsA诱导的GVHD，之所以选择IFN－α来增强CsA诱导的GVHD是基于3个重要的临床观察：①IFN－α对各种靶细胞有多效性的生物作用，BMT中IFN－α增强免疫应答最显著的作用与它增强MHC决定簇的表达和NK细胞活性有关；②在研究ALL患者allo－BMT后用IFN－α预防巨细胞病毒感染时发现，接受IFN－α患者的复发率明显降低；③有报道，在IFN－α治疗各类恶性肿瘤患者时，部分患者出现免疫功能紊乱[26]。
ABMT后35天给予IL－2和LAK细胞治疗，结果显示ABMT后IL－2治疗能诱导大多数患者产生类似于急性GVHD的病理学改变，表现为皮疹，皮肤病理显示≥Ⅱ度的组织学变化，有T细胞浸润。IL－2诱导GVHD的机制仍不清楚。LAK细胞能识别靶细胞上改变了的粘附分子，而IL－2对实体肿瘤的治疗与皮肤增高的内皮细胞粘附分子(ELAM)和细胞内粘附分子(ICAM1)表达有关，有可能这种分子表达的增高能增加LAK细胞与表皮和真皮细胞的结合，从而使皮肤遭到损害，导致GVHD的组织学改变[27]。
5 小结 造血干细胞移植存在着GVL，异基因移植中的GVHD有GVL作用，而GVL可以不依赖于GVHD。如何提高移植后的GVL作用，同时避免GVHD相关死亡率是当今研究的热点。ABMT后用IL2、CsA和IFN－α等诱导GVL可以降低移植后的复发率，在GVL的效应机制中，T细胞和NK细胞起重要作用，其分子机制尚在深入研究中。
作者单位：上海，第二军医大学长海医院血液科 200433
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(收稿：1999－04－12)
(校对：王叶青)
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