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抗氧化剂槲皮素诱导人白血病HL-60细胞凋亡作用

抗氧化剂槲皮素诱导白血病HL-60细胞凋亡作用

中华血液学杂志 2000年第6期第21卷 研究报告

作者:李忌 陈俊杰 高小平 周健 罗弟祥 李伯刚

单位:李忌 陈俊杰(610041 成都,华西医科大学基础医学院医学分子生物学开放实验室);高小平 周健 罗弟祥 李伯刚(中国科学院成都地奥制药公司新药部)

  槲皮素(quercetin,Que)是一种存在于多种植物中的黄酮类化合物,有较强的抗氧化作用[1]。以往的研究结果表明,Que可抑制多种肿瘤细胞的生长,且可加强某些抗癌药物的抗癌作用[1,2];Que对白血病细胞的DNA合成有抑制作用[3]。因而,Que被认为是颇具应用前景的抗癌药物或抗癌辅助药物,但Que的作用机制尚未阐明。我们的研究结果显示,Que可有效诱导白血病HL-60细胞发生凋亡,且引发抗凋亡基因bcl-2的蛋白发生降解。

材料和方法

  1 试剂 Que、噻唑蓝(MTT)及碘化丙锭(PI)为Sigma公司产品,其它常用试剂均为国产分析纯。

  2 细胞培养及存活率测定 HL-60细胞由本室长期传代,以1×105/ml浓度接种于含体积分数为10%的灭活胎牛血清(FCS),100U/ml 青霉素,100μg/ml 链霉素的新鲜RPMI 1640(Gibco公司产品)培养液中培养(37℃,体积分数为5%的CO2)。采用MTT法测定细胞存活率[4]

  3 细胞形态学观察 HL-60细胞与一定浓度Que共同培养不同时间后,于倒置显微镜下观察或制成细胞涂片,经Giemsa染色后于光镜下观察。

  4 流式细胞仪计数分析[5] 收集细胞,用体积分数为70%的乙醇4℃固定4h后,加入RNA酶(终浓度为50μg/ml) 37℃反应1h,再用PI(浓度为100μg/ml)溶液染色20~30min后,用流式细胞仪(Becton Dickinson 公司,美国)分析。

  5 细胞DNA片段化分析 收集细胞(106个细胞以上),加入裂解液(10g/L NP40,20mmol/L EDTA,50mmol/L Tris-HCl,pH7.5)反应10s。离心收集上清,加入SDS至10g/L浓度,并用RNA酶(终浓度50μg/ml)56℃作用1~2h,然后再加入蛋白酶κ至2.5mg/ml,37℃处理2h,用乙醇沉淀DNA,用10~20μl TE溶解DNA,在10g/L琼脂糖凝胶中电泳。

  6 Western blot分析[6] 提取经Que处理后的细胞总蛋白质,用BCA检测试剂盒(Sigma公司)进行定量。取30μg蛋白质样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE,120g/L),转膜,按照ECL Western blot试剂盒(Amershan公司)的程序进行Western blot,第一抗体为兔抗Bcl-2单抗(Santa公司)。

结 果

  1 Que抑制HL-60细胞增殖 不同浓度Que对HL-60细胞生长有抑制作用,这种作用呈时间、剂量依赖性。随Que浓度的增加细胞存活率降低(见图1)。时效关系曲线与量效关系曲线相似。

  2 Que对HL-60细胞形态学影响 经100μmol/L Que处理HL-60细胞24h后,HL-60细胞表现凋亡细胞的特征性形态变化:细胞体积缩小、细胞核固缩、膜起泡、核断裂及形成凋亡小体等。

  3 流式细胞仪分析HL-60细胞DNA含量 经不同浓度Que处理后的HL-60细胞,可见DNA含量低于G1期的凋亡细胞群,这群细胞的百分率随Que浓度的递增而增加(图2)。

  4 DNA电泳 100μmol/L的Que处理HL-60细胞24h和48h后,DNA琼脂糖凝胶电泳显示梯状降解条带。

  5 Que使Bcl-2发生降解 HL-60是一种Bcl-2高表达的细胞系[7],经Western blot分析,我们发现100μmol/L Que处理HL-60细胞24h或48h,均导致Bcl-2发生降解(图3),与标准分子量Marker比较并计算得知:大片段相对分子质量为25×103,类似于Bcl-2α同工酶[8];小片段为20×103。目前,它的功能还不得而知。

图1 不同浓度Que作用于HL-60细胞24h的量效关系曲线

图2 流式细胞仪分析HL-60细胞凋亡情况

1:对照组;2:100μmol/L Que处理24h;3:100μmol/L Que处理48h

3 Western blot分析Bcl-2降解情况

讨 论

  本研究结果表明,Que在100 μmol/L时能有效诱导HL-60细胞发生凋亡,表现为:①形态学上细胞体积缩小、核浓缩致密及凋亡小体形成;②琼脂糖凝胶电泳有梯状条带出现;③流式细胞术检测有亚G1峰出现。并且这种凋亡的作用有时间和浓度依赖性,Western blot检测发现Que诱导HL-60细胞凋亡过程中,引发Bcl-2蛋白降解为相对分子质量为25×103和20×103的片段。

  有关Que诱发Bcl-2降解的研究尚未见报道。Bcl-2的降解提示有相关蛋白酶的激活,凋亡发生是一个复杂的由caspases家族成员介导的蛋白酶级联反应过程,相对分子质量为20×103的降解产物的产生还不知是何种caspases激活所致[8]。不同类型细胞由于其生物学特性不同,发生凋亡时可能存在不同的蛋白酶激活,Bcl-2也可能作为多种蛋白酶的底物被降解。Que诱发HL-60细胞的Bcl-2发生降解,可能是激活了相关蛋白酶,具体机制有待进一步研究。

  我们根据自己及其他实验室的实验结果提出:细胞氧化还原平衡状态的改变是导致细胞凋亡的重要原因,因此,抗氧化剂Que诱导HL-60细胞发生凋亡可能与它改变细胞氧化还原状态的平衡有关。

  参考文献

  1,Eiattar TMA, Virji AS. Modulating effect of resveratol and quercetin on oral cancer cell growth and proliferation. Anti-Cancer Drugs, 1999, 10:187-193.

  2,Elia G, Santoro MG. Regulation of heat shock protein synthesis by quercetin in human erythroleukaemia cells. Biochem J, 1994, 300:201-209.

  3,Uddin S, Chaudhry MA. Quercetin, a bioflavonoid, inhibits the DNA synthesis of human leukemia cells. Biochem Mol Biol Int, 1995, 36:545-551.

  4,王振华,李忌,郑荣梁,等. 菰帽悬钩子三萜糖酯的体外抗肿瘤活性. 中国药学杂志, 1999, 34:163-164.

  5,Li X, Melamed MR, Darzynkiewicz Z. Detection of apoptosis and DNA strand breaks with fluorochromes of different color. Exp Cell Res, 1996, 222:28-37.

  6,Grandgirard D, Studer E, Monney L, et al. Alphaviruses induce apoptosis in Bcl-2-overexpressing cells:evidence for a caspase-mediated, proteolytic inactivation of Bcl-2. EMBO J, 1998, 17:1268-1278.

  7,Kawaii S, Tomono Y, Katase E, et al. Acridones as inducers of HL-60 cell differentiation. Leukemia Res, 1999, 23:263-269.

  8,Yamamoto AM, Eloy L, Bach JF, et al. N-terminus cleavage of bcl-2 by a novel cellular non-ICE cysteine proteinase. Leukemia, 1998, 12:1467-1472.

  9,Slater AFG, Nobel CSI, Orrenius S. The role of intracellular oxidants in apoptosis. Biochim Biophys Acta, 1995, 1271:59-62.

(收稿日期:1999-06-25)


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