您所在的位置:首页 > 专题栏目 > 乳癌专题 > 文献资料 用户登录 新用户注册
P物质对白血病细胞系HL-60及L615细胞生长的抑制作用

P物质对白血病细胞系HL-60及L615细胞生长的抑制作用

中华血液学杂志 2000年第6期第21卷 研究报告

作者:杨琳 康芙蓉 法祥光 卢士红

单位:300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所

  近年已发现多种神经肽参与正常和异常细胞的增殖调节,神经多肽P物质(SP)即是其中一种,它主要分布在的神经系统,已发现SP对小细胞肺癌、类癌瘤有促生长作用[1]。但SP对肿瘤生长的影响研究尚属起始阶段,其对肿瘤细胞生长是否有直接影响,作用方式和特点又是如何则所知甚少。为此,我们以粒细胞白血病HL-60细胞和小鼠T淋巴细胞白血病L615细胞为模型,探讨了SP对其生长的影响及其调节机制。

材料和方法

  1 细胞系、实验动物及有关试剂 HL-60细胞、L615细胞由本所实验病理研究室提供,BALB/c裸鼠购自中国医学科学院肿瘤医院,615近交系小鼠购自中国医学科学院动物中心,SP购自杭州商学院,百日咳毒素(PT)、PKC检测试剂盒均为美国Gibco/BRL公司产品,γ-32P-ATP为北京辉瑞生物制品公司产品。

  2 分组 接种细胞处于对数生长期,浓度为1×105/ml,分别设对照组(不加SP)和试验组(加SP),在体积分数为5%的CO2孵箱中共温育48h后离心,1000r/min,10min,收集细胞,进行以下试验。

  3 活细胞计数和MTT试验 试验组设10-7,10-6和10-5mol/L SP组,分别进行活细胞计数和MTT试验。

  4 电镜观察和流式细胞仪检测 细胞总数不少于107,按常规进行电镜观察,用流式细胞仪计数10000个细胞,检测细胞凋亡情况。

  5 G蛋白相关试验及PKC活性测定 150ng/ml PT先与细胞在37℃共温育1h,用MTT法检测细胞与SP共温育时PT对细胞生长的抑制作用,进而判别SP对G蛋白的影响。PKC活性测定按试剂盒说明书进行。

  6 致瘤性试验 ①裸鼠试验:收集HL-60和L615细胞,分别制成0.6ml细胞悬液,各接种3只裸鼠(5周龄左右,接种前经400cGy射线预处理),接种细胞数为1.8×107/只,皮下注射。②615小鼠试验:收集HL-60和L615细胞,分别制成1ml细胞悬液,各接种5只615小鼠(20g左右),接种细胞数为1.2×107/只,皮下注射。

  7 统计学处理 实验数据采用t检验处理。

结果

  1 SP对HL-60、L615细胞生长的影响

  1.1 活细胞计数:分别观察不同浓度SP对两株细胞生长的影响,设对照组为100%,活细胞数以相对百分率表示,结果10-7mol/L和10-5mol/L SP处理的HL-60细胞生长抑制率分别为85.4%和81.9%与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05);10-7mol/L和10-5mol/L SP处理48h的L615细胞生长抑制率分别为87.2%和77.0%,与对照组比较,P均<0.05。表明10-7~10-5mol/L剂量范围的SP作用48h后对两株细胞均有抑制作用,且高浓度SP比低浓度SP的抑制作用更明显。

  1.2 MTT试验:测定两株细胞经不同浓度SP作用不同时间后的吸光度(A)设对照组细胞活力为100%,结果见图1,2。

  结果表明,各种浓度的SP在不同时间内对两株细胞的生长均有抑制作用,且与计数法结果相符。虽然48h的抑制作用稍低于36或72h的作用,但由于36h细胞未进入对数生长期而72h又使实验周期过长,故设定SP浓度为10-5mol/L、作用48h为其它研究的实验条件。

  2 SP对HL-60和L615细胞形态的影响 电镜观察显示,对照组和实验HL-60细胞形态上无明显区别,细胞核也无明显变化,表明SP对HL-60细胞的抑制生长作用不是通过凋亡方式;L615细胞经SP作用后大多数细胞的染色质完全消失或边集,且随SP浓度增加,核的这种变化加重,但胞浆中的细胞器完好,且无凋亡小体出现,提示可能是凋亡早期。

图1 不同浓度SP对HL-60作用不同时间的MTT结果

图2 不同浓度SP对L615细胞作用不同时间的MTT结果

  3 流式细胞仪检测结果 用流式细胞术检则经SP作用后的两株细胞核DNA的亚二倍体含量。结果显示经SP分别作用9,12,24和48h后,HL-60细胞的凋亡百分率差异无显著性。而9h(低限)和48h(高限)L615细胞凋亡百分率均明显增加,9h后实验组凋亡率为(31.06±17.72)%,比对照组的(19.45±9.71)%上升了57.60%(n=7,P<0.05);48h后实验组细胞凋亡率为(15.43±5.47)%,比对照组的(10.05±5.12)%上升了62.49%(n=7,P<0.05)。提示SP抑制HL-60细胞生长不是通过增加细胞凋亡实现的,而对L615的抑制是通过凋亡实现的,与电镜结果非常一致,表明SP抑制两株细胞生长的作用方式不同。

  4 SP与异三聚体G蛋白的相关性 PT特异性阻遏G蛋白功能,判别SP的抑制作用是否由G蛋白介导。150ng/ml的PT可以显著地抑制HL-60、L615细胞生长,抑制率分别是(16.48±4.58)%(n=6,P<0.05)和(13.96±4.81)%(n=5,P<0.05)。当PT和SP共同作用于细胞时,PT对HL-60、L615的抑制作用均被拮抗,抑制率分别下降为(2.92±0.20)%(n=6,P>0.05)和(7.42±5.01)%(n=5,P<0.05)。显示SP可拮抗PT对G蛋白的抑制作用,也表明SP对G蛋白有激活作用。

  PKC活性检测结果表明,与对照组相比SP可使HL-60和L615细胞的PKC活性增强,分别为(18.94±4.19)%(n=5,P<0.01)和(16.40±9.73%)%(n=4,P<0.05)。

  5 致瘤性试验

  5.1 裸鼠试验:HL-60细胞为粒细胞白血病细胞系,因裸鼠缺乏T细胞,故接种HL-60细胞后无排斥反应,会在接种局部生成瘤块。经SP处理后的HL-60细胞致瘤性降低:实验组比对照组肿瘤潜伏期延长4d,且瘤块增长较慢,接种第10天对照组与实验组瘤块平均分别为111.35mm3、0mm3;第13天两组分别为335.78mm3、143.24mm3

  5.2 L615近交系小鼠试验:经SP处理后的L615细胞致瘤性降低,对照组动物在接种后8d内死亡3只,而实验组动物在21d内全部存活下来,生存时间明显延长。

讨论

  实验结果表明,SP在10-7~10-5mol/L浓度范围内对两株肿瘤细胞的生长均有抑制作用,且抑制率稳定的低值(约10%)水平,电镜观察和流式细胞术检测表明SP对HL-60细胞的生长抑制作用并非是通过诱导凋亡途径。而SP对L615细胞的抑制作用则可能是凋亡所致。结果表明SP对两株细胞的抑制作用是一种非杀伤性的调节作用。

  我们以G蛋白特异性抑制剂PT作参照物,观察SP对G蛋白的影响。发现SP对PT的抑G蛋白作用有明显拮抗性,表明SP可能是激活了G蛋白活性而呈现对PT的拮抗,这点从SP可增高PKC活性而进一步得到证实。因此,SP对两株细胞生长的抑制作用可能是其与相应受体结合后进一步激活G蛋白而始动的,而G蛋白的激活是进一步激活PLC-PKC、MAPK等重要信息途径的超始环节。PKC是调节细胞生长、发育、凋亡及多种细胞行为的重要分子,它对细胞生长的调节具有双向性[2,3],其正负调控倾向由多种因素和细胞所处的特定环境所决定。实验中与SP共育的两株细胞的PKC活性均明显升高,表明SP对两株细胞生长的抑制作用与PKC活性增高有关。

  在体内实验中,根据致瘤性试验的结果可知经SP作用后的两株瘤细胞对动物的致瘤能力均明显降低,也表明SP对两株瘤细胞生长有抑制作用。SP可延长615小鼠的生存时间,在HL-60细胞致瘤性试验中则出现裸鼠肿瘤潜伏期延长数天后,肿瘤突然加速生长。这进一步验证了SP对两株细胞的抑制生长作用机制是不同的,对HL-60细胞的抑制作用可能是一种未达到凋亡的可逆过程,只要SP存在就表现为抑制生长,一旦SP解除或作用消失,瘤细胞则象脱离了“禁锢”似的生长起来。

  志谢:本工作得到褚建新、应红光及赵钧铭等同志的诸多帮助,特此致谢

  基金项目:国家自然科学基金资助项目(39470273)

  参考文献

  1,Sethi T, Longdon S, Smyth J. Growth of small cell lung cancer cells: stimulation by multiple neuropeptides and inhibition by broad spectrum antagonists in vitro and in vivo. Cancer Res, 1992, Supll 52:2737-2742.

  2,Ojedas F, Guarda MI, Maldonato C. Protein kinase C involvement in thymocyte apoptosis induced by hydrocortisone. Cell Immunol, 1990, 125:535-539.

  3,David-Jarvis W, Turner AJ, Povirk LF. Induction of apoptotic DNA fragmentation and cell death in HL-60 human premyelocytic leukemia cells by pharmacological inhibitor of protein kinase C. Cancer Res, 1994, 54:1707-1714.

(收稿日期:1999-05-18)


页面功能 参与评论】【字体: 打印文章关闭窗口
下一编:caspase3在细胞因子调节急性白血病细胞凋亡中的变化
焦点新闻
·白细胞介素6对急性髓系白血病细胞生长及核因子激活的
·急性白血病患者止血功能检测的临床意义
·急性白血病患者酪氨酸激酶基因BMX表达及其临床意义
·中期荧光原位杂交技术在t(8;21)白血病随访中的应用
·直接原位逆转录-聚合酶链反应检测慢性粒细胞白血病bcr
·婴儿急性白血病的临床和分子生物学特点
·小儿急性髓系白血病微分化型一例
·急性髓系白血病细胞粘附分子Mac-1、LFA-1、L-选择素的
温馨提示:如果您怀疑自己有某种健康问题,可到健康社区交流咨询或尽快去医院就医治疗。

栏目列表