反义c-myc基因抗L6565白血病作用的研究

中华血液学杂志 1999年第12期第20卷 研究报告

作者：赵新永　殷莲华　孔宪寿　杨轶群

单位：200032　上海医科大学病理生理学教研室

　　小鼠L6565白血病是我国特有的T-S-Z实验性白血病/淋巴瘤系统中的实验动物模型之一^［1］。我室用L6565白血病小鼠的脾脏细胞悬液以有限稀释法建立了L6565细胞株，在对其早期癌基因进行筛选时，发现c-myc基因过度表达，这提示c-myc的高表达可能与L6565白血病的发生机制有关^［2］。为了进一步探索c-myc与L6565白血病发病机制的关系及反义c-myc对其治疗作用，我们针对高表达的c-myc构建了一个含有反义c-myc基因的逆转录病毒载体，观察它对L6565白血病细胞株恶性表型和恶性行为的影响。

　　材料和方法

　　1　细胞株和主要试剂　L6565白血病细胞株是本教研室建立的克隆细胞株，PA317包装细胞系、NIH/3T3细胞系均由ATCC提供。各种工具酶及c-myc单抗购自Promega公司，G418、Polybrene、MTT购自Sigma公司，ABC试剂盒购自华美生物工程公司，磷酸钙-DNA转染试剂盒和dNTP购自Pharmacia公司。

　　2　载体构建　逆转录病毒载体PGNC、pSVcmycl(在BamHI-Xbal位点插入了小鼠c-myc基因，含有外显子2和3,插入片段长4.8 kb)购于ATCC。将构建好的含有反义c-myc载体和空载体命名为PGNCas和PGNCneo。

　　3　DNA转染　采用DNA-磷酸钙共沉淀法分别将PGNC和PGNCas DNA转移入PA317细胞中，用G418进行筛选得到阳性克隆细胞PA317/PGNCneo和PA317/PGNCas。将这两种细胞以5×10⁵/ml培养24小时，收集上清，3 500×g离心10分钟，吸取上清测病毒效价。

　　4　细胞培养　PA317、NIH/3T3细胞均用含体积分数为10%小牛血清的DMEM培养液培养，用1.25 g/L胰蛋白酶液消化。L6565细胞用含体积分数为10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养，置于37 ℃，体积分数为5%的CO₂培养箱内水平式培养。将得到的病毒PGNCneo和PGNCas分别感染L6565细胞，经G418筛选，分别得到L6565neo和L6565as细胞。用L6565和L6565neo细胞作对照。

　　5　形态学观察　显微镜下观察L6565as细胞和对照组细胞的生长情况，并作显微摄片。

　　6　细胞生长曲线的绘制　用MTT法,参照试剂盒说明进行。

　　7　流式细胞仪分析细胞周期　取2×10⁶细胞用PBS洗后，加1.8 ml胰酶消化液在37 ℃消化数分钟，再加1.5 ml胰

　　本课题受上海市教委高校科技发展基金(97JG05053)资助

　　酶抑制液终止胰酶消化，加1.5 ml碘化丙锭染色15分钟，每一标本取1×10⁴细胞进行分析。

　　8　软琼脂集落形成实验参照文献［3］进行。

　　9　免疫组织化学检测c-myc蛋白　采用常规ABC法。

　　结　果

　　1　c-myc蛋白检测　L6565细胞和L6565neo细胞c-myc蛋白表达为强阳性，而L6565as细胞为弱阳性，其免疫组织化学灰度扫描值分别为10 029.33±355.13，10 701.20±583.36和3 043.28±599.28，经统计学分析差异有显著性。

　　2　形态学观察　L6565neo和L6565细胞形态差别不大，细胞密集生长，呈圆形或类圆形，高倍镜下细胞大小差异悬殊，L6565as细胞大小较一致，呈圆形。

　　3　反义c-myc对L6565细胞生长的影响　结果见图1，从生长曲线看，L6565as细胞与L6565、L6565neo细胞相比，生长速度明显减慢。

1　L6565、L6565neo和L6565as细胞生长曲线(MTT法)

　　4　细胞周期检测　流式细胞仪分析结果表明，反义c-myc基因阻碍了L6565细胞进入S期，使细胞阻滞于G₀／G₁期，与对照组相比，其G₀／G₁期细胞明显增加，而S期细胞相对减少，结果见表1。

表1　反义c-myc对L6565细胞周期的影响(±s)

　　 5　软琼脂集落形成能力　L6565as细胞的软琼脂集落形成能力与对照组细胞相比显著降低。L6565、L6565neo和L6565as的集落数分别为(27.3±3.1)/2×10⁶细胞、(28.7±2.5)/2×10⁶细胞和(9.0±2.8)/2×10⁶细胞(两两比较，P值均＜0.01)。讨　论

　　我们将构建的反义c-myc基因导入L6565白血病克隆细胞，导入反义c-myc基因的L6565细胞的c-myc蛋白显著下降，而对照细胞c-myc蛋白表达依然呈强阳性，表明反义RNA抑制了c-myc的表达。c-myc蛋白的下降可能是由两方面因素引起的：一方面是因为反义RNA和mRNA结合导致mRNA不能翻译；另一方面是因为反义RNA负性调控c-myc的转录。c-myc蛋白的下降，也说明了我们构建的反义c-myc基因在细胞内确实得到了高效表达。

　　导入反义c-myc基因的L6565细胞与对照细胞相比，表现为：①细胞形态变圆，大小变得较均一；②细胞生长速度降低；③细胞在体外软琼脂中集落形成减少；④细胞周期检测发现细胞阻滞于G₀／G₁期。结果表明反义c-myc确实对L6565白血病细胞有抑制作用，并且可能还有部分促分化作用，使L6565白血病细胞向正常细胞的成熟阶段分化，细胞恶性程度降低，这与严开平等^［4］用反义寡核苷酸抑制SACⅡB2细胞(与L6565细胞属于同一系统的淋巴瘤细胞株)中高表达的c-fos基因时，细胞分化时的形态变化一致。可以初步认为，这种细胞形态变化是由于细胞向成熟阶段分化所导致的。从生长曲线上发现在第5天对照细胞和L6565neo细胞生长曲线呈下降趋势，而L6565as细胞的生长基本上仍呈上升趋势，产生这种情况的可能原因是L6565细胞生长过快，在第4天生长达到最高峰，以后由于细胞过多，营养不足，以致细胞大量死亡。而L6565as细胞生长缓慢，细胞数量较少，可获得足够的空间和营养而继续生长，故死亡率低。

　　细胞周期检测表明，L6565as细胞和对照细胞相比细胞被阻滞于G₀／G₁期。一般认为细胞增殖的速度主要与G₁期的长短有关，阻滞细胞从G₁期进入S期就可抑制细胞增殖。现在已经证明c-myc基因的产物为细胞从G₁期进入S期所必须，抑制c-myc就可抑制细胞从G₁期进入S期，从而抑制肿瘤细胞的快速增殖。本实验结果也验证了这一点。我们发现L6565neo细胞的周期分布和L6565细胞相比有所不同，导致这种情况的原因不清楚。

　　参考文献

　　1　程立. 实验性T-S-Z白血病系统的研究(1980-1986). 自然杂志，1987，10：937.

　　2　殷莲华，郑颂国，程立. L6565小鼠白血病癌基因表达的初步研究. 中国病理生理杂志，1997，13：173-175.

　　3　邓平，程立，孔宪寿. 维生素A酸诱导分化小鼠淋巴细胞白血病/淋巴瘤的实验研究. 实验肿瘤学杂志，1990，4：1.

　　4　严开平，殷莲华，郑颂国，等. 反义c-fos寡脱氧核苷酸对淋巴瘤细胞株SACⅡB2恶性表型抑制的研究. 中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4：58-60.

收稿：1998-07-15　　修回：1999-04-15