急性非淋巴细胞白血病肺耐药相关蛋白表达的初步研究

中华血液学杂志 1999年第10期第20卷 研究报告

作者：叶欣　刘忠民　李秀兰　滕清良　黎爱华　孙兆刚　李毅　杨宪勇

单位：叶欣　刘忠民　李秀兰　滕清良　黎爱华　孙兆刚　李毅　杨宪勇　271000　山东省泰安市中心医院

　　最近,Scheper等^［1］发现一种与产生多药耐药(MDR)相关的蛋白质,即肺耐药相关蛋白(Lung resistance-related protein,LRP)。我们对39例急性非淋巴细胞白血病(ANLL)细胞中LRP表达情况与临床疗效的关系进行了初步研究,现报道如下。

　　病例和方法

　　1　研究对象

　　ANLL 39例,男23例,女16例;年龄13～62岁,中位年龄37岁。按FAB分类M₁ 9例,M₂ 9例,M₃ 7例,M₄ 8例,M₅ 5例,M₆ 1例。按Hiddemann标准^［2］,初治者21例,复发及难治者18例。ANLL诊断均经临床、细胞形态学、组织化学染色而确诊。对照组为14名正常献血员,男9名,女5名;年龄21～46岁,中位年龄34岁。

　　2　方法

　　2.1　试剂:鼠抗人LRP-56单抗为Scheper教授惠赠;链霉亲和素-生物素-亲和素过氧化物酶复合物(SABC)、Poly-Lysine粘附剂及DAB显色剂均为武汉博士德生物工程有限公司产品;淋巴细胞分离液为中国医学科学院血液学研究所产品;MTT试剂为Sigma公司产品;柔红霉素(DNR)为意大利爱宝公司产品。

　　2.2　标本制备及染色:取患者外周血或骨髓5ml,健康人外周血5ml,肝素30U/ml抗凝。用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,将单个核细胞终浓度调到2×10⁹/L,取50μl滴加在涂片离心机上1500r/min离心5分钟制片(玻片须经Poly-Lysine处理),37℃干燥2小时或4℃冰箱过夜,冷丙酮固定,-80℃冰箱保存备用。按SABC法染色,油镜下计数500个细胞中的阳性细胞(以PBS缓冲液代替LRP-56单抗为阴性对照)。判定阳性细胞的标准:LRP表达阳性的标志为细胞浆中见到黄色或棕黄色的粗颗粒;阳性细胞≥0.10为(+),0.11～0.20为(++),0.21～0.30为(+++),0.31～0.50为(++++)^［3］。LRP阴性表达的细胞胞浆中无特殊染色颗粒。

　　2.3　MTT试验:方法参考文献［4］,选DNR的血峰值为用药浓度,观察DNR对白血病细胞的抑制率;≥50%为敏感,＜50%为耐药。

　　3　临床治疗方案

　　初治组21例中有9例用HA(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷)方案;8例用DA方案(D为柔红霉素);4例(均为M₃)用全反式维甲酸。18例复发及耐药组中有4例用HDA方案;6例用DEA方案(E为足叶乙甙);8例用MEA方案(M为米托蒽醌)。疗效按国内标准^［5］评定。

　　4　统计学处理

　　结果用χ²检验。

　　结　果

　　1　LRP在正常人血细胞及ANLL中的表达

　　正常组中仅有1名阳性,表达强度为(+);ANLL初治组21例患者中有7例表达阳性,表达强度1例(+),3例(++),1例(+++),2例(++++),其阳性表达率与正常组比较,χ²=6.72,P＜0.01;ANLL复发及难治组18例中有11例表达阳性,表达强度2例(++),5例(+++),4例(++++),其阳性率与正常组和初治组比较,χ²=7.69和6.91,P均＜0.01。

　　2　LRP表达与DNR对白血病细胞抑制率的关系

　　初治组21例中有14例LRP表达阴性,对DNR敏感的有9例;LRP表达阳性的7例中仅有1例对DNR敏感,两者比较,χ²=6.65,P＜0.01。复发及难治组18例中有7例LRP表达阴性,1例对DNR敏感;LRP表达阳性的11例中1例对DNR敏感,两者比较,χ²=0.12,P＞0.05。

　　3　LRP表达与临床疗效的关系

　　在初治组，LRP表达阴性的14例中10例完全缓解(CR),占71.4%;表达阳性的7例中仅1例CR,占14.3%,两者比较,χ²=8.42,P＜0.01。复发及难治组，LRP表达阴性的7例中1例CR(14.3%);表达阳性的11例中2例CR(18.2%),两者比较,χ²=0.05,P＞0.05。

　　讨　论

　　由于LRP最早发现于人非小细胞肺癌P-gp阴性的MDR细胞系SW-1573/2R120中,因此,被命名为LRP。其基因定位于16p13.1-16p11.2,LRP cDNA全长2.8kb,编码一个相对分子质量约为110×10³的非糖类蛋白质。LRP广泛地分布在正常组织和肿瘤组织中,在正常组织中其分布有一定的组织特异性,如支气管上皮、肠道上皮、肾小管上皮、肾上腺皮质等,且表达率较低，肿瘤组织中LRP的表达率比正常组织中高,且不同的肿瘤其表达率也不尽相同^［1,6,7］。Scheper等研究认为,LRP引起MDR的机制是:①LRP可以阻止某些以细胞核为效应点的药物通过核孔进入细胞核,并可将已进入细胞核的药物转运到细胞浆中;② 进入细胞浆中的药物可被转移到运输囊泡中,并以胞吐方式排出到细胞外。基于上述LRP引起MDR的机制，结合ANLL化疗药物的药理特点,研究ANLL患者白血病细胞中LRP的表达情况与MDR的关系具有十分重要的意义。

　　我们的研究表明，LRP在正常组外周血细胞中有较低表达,表达率是7.1%;而LRP在初治ANLL中的表达率是33.3%,明显高于正常组(P＜0.01)；复发及难治组中LRP的表达率是61.1%,明显高于正常组和初治组(P均＜0.01),这说明临床耐药与LRP表达率可能有一定关系。

　　List等^［3］研究了66例ANLL患者LRP表达情况与临床预后的关系,发现LRP⁺者CR率35%,而LRP^-者CR率68%,提示有独立的预后意义。我们发现初治组LRP^-患者CR率(71.4%)明显高于LRP⁺患者(14.3%),也说明LRP表达情况与临床疗效有密切关系。

　　我们发现复发及难治ANLL患者LRP的表达与CR率之间并无明显的联系,说明在体内产生MDR的机制是多因素的,MDR还与P-gp、MRP、bcl-2、Topo-Ⅱ、GST等有关。我们正在积累病例以探讨LRP、P-gp、MRP和bcl-2相互之间与MDR的关系。

　　志谢:承蒙张华治主任医师的精心指导,在此表示感谢

　　参考文献

　　1　Scheper RJ,Broxterman HJ,Scheffer GL,et al. Overexpression of a (Mr) 110000 vesicular protein in non-P-glycoprotein-mediated multidrug resistance.Cancer Res,1993,53:1475-1479.

　　2　Hiddemann W,Martin WR,Sauerland CM,et al.Definition of refractoriness against covention chemotherapy in AML——a prosposal based on the result of retreatment by thioguanine,cytosine arabinoside and daunorubicin(TAD9) in 150 patients with relapse after standardized first line therapy. Leukemia,1990,4:184-189.

　　3　List AF,Spier CS,Grogan TM,et al.Overexpression of the major vault transporter protein lung-resistance protein predicts treatment outcome in AML.Blood,1996,87:2464-2469.

　　4　罗梅华,卞寿庚,冯敏,等.药敏试验MTT法对急性白血病化疗疗效的预示价值.实验血液学杂志,1995,3:57-59.

　　5　张之南,主编.血液病诊断及疗效标准.第1版.天津:天津科学技术出版社,1991.132-134.

　　6　Scheffer GL,Wijngaard PLG,Flens MJ,et al.The drug resistance-relatedprotein LRP is the human major vault protein.Nature Med,1995,1:578-582.

　　7　Slovak ML,Ho JP,Cole SP,et al.The LRP gene encoding a major vault protein with drug associated maps proximal to MRP on chromosome 16:evidence that chromosome breakage plays a key role in MRP or LRP gene amplification.Cancer Res,1995,554214-554219.

收稿:1999-01-20

　　修回:1999-05-10