bcl-x和bcl-2基因在急性白血病患者中的表达及其临床意义
中华血液学杂志 1999年第7期第20卷 论著
作者：申徐良 王椿 乔振华 乔中东 魏武 张斌严 史文芝
单位：申徐良 魏武 张斌严 史文芝 046000山西省长治市,长治医学院附属医院血液科王椿 上海市第一人民医院血液科；乔振华 山西医科大学第二临床医学院；乔中东 山西医科大学分子生物学实验室
关键词： 白血病基因，bcl-x基因，bcl-2
摘要 目的观察凋亡调控基因bcl-x和bcl-2在急性白血病(AL)患者中的表达，探索AL的病理和化疗反应的分子机制。方法应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测bcl-x（bcl-xL、bcl-xS）和bcl-2在34例AL患者中mRNA水平的表达。结果抑凋亡基因bcl-xL和bcl-2在AL细胞中的表达比在完全缓解和正常对照者骨髓细胞中的表达明显增高（P0.01），同时在复发患者AL细胞中的表达水平分别是初治患者的1.8倍和1.9倍(P0.01)。bcl-xL和bcl-2的表达以及bcl-xL和bcl-xS的表达均呈正相关（P0.01）,但个体间有较大差异。未发现bcl-xS表达水平与AL的复发和疗效有关；治疗无效患者bcl-xL和bcl-2的表达比治疗有效者高(P0.01)，bcl-xL、bcl-2和此两基因同时高表达的患者临床治疗无效率分别为80.0％、91.7％和100.0％。结论AL的发病可能与抑凋亡基因bcl-xL和bcl-2的高表达有关;bcl-xL或bcl-2的高表达可以降低AL的化疗敏感性,而且是AL复发的高危因素。
Detection and evaluation of bcl-x and bcl-2 gene expression in blasts from patients with acute leukemia
SHEN Xuliang WANG Chun QIAO Zhenhua et al
Department of Hematology, Affiliated Hospital of Changzhi Medical College, Changzhi 046000
Abstract Objective To investigate the expression of bcl-x and bcl-2 genes in bone marrow cells of acute leukemia and their effects on response to chemotherapy. Methods Semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the mRNA expressions of bcl-xL, bcl-xS and bcl-2 in blast cells from 34 acute leukemia(AL) patients. Results The expression of bcl-xL and bcl-2 or both in blast cells from 34 AL patients was higher than that in complete remission patients and normal subjects. The expression of bcl-xL and bcl-2 in relapsed patients was increased by 1.8 and 1.9 fold, respectively, compared with that in the newly diagnosed patients(P0.01). However, no relationship was found between the expression of bcl-xS and the relapse and chemotherapeutic response of the AL patients. There were positive correlations between the expression of bcl-xL and bcl-2 or bcl-xL and bcl-xS. The expression level of bcl-xL and bcl-2 in the patients with poor response to chemotherapy was significantly higher than that in the patients with better response. Treatment failure occurred in 80.0％ , 91.7％ and 100.0％ of the patients with overexpression of bcl-xL and bcl-2 and both, respectively. Conclusion Overexpression of bcl-xL and bcl-2 may imply the lower sensitivity of the leukemic cells to chemotherapy and higher risk of relapse.
Key words Leukemia Gene， bcl-x Gene,bcl-2
bcl-2基因家族是重要的凋亡调控基因，其中新近克隆的bcl-x可以通过不同的剪接机制产生2种大小不同、功能相反的mRNA，即bcl-xL和bcl-xS。bcl-xL编码233个氨基酸，比bcl-xS多63个，而这63个氨基酸与bcl-2蛋白有73％的同源区域。bcl-xL的产物与bcl-2蛋白相似，能抑制多种因素诱导的凋亡。bcl-xS编码蛋白则有促进凋亡的作用[1-3]。最近，上述基因的异常表达对肿瘤的发病及其对化疗反应的影响引起人们广泛关注。我们应用半定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）的方法检测bcl-xL、bcl-xS和bcl-2基因在34例急性白血病(AL)患者骨髓细胞中mRNA水平的表达，探讨凋亡调控基因的表达状态对AL发病、复发及化疗反应的影响。
病例和方法
1 病例 AL34例中来自长治医学院附属医院血液科6例,山西医科大学第二临床医学院血液科28例,均经FAB分型确诊，其中28例经MIC分型确诊。急性髓系白血病(AML)21例(其中M11例、M23例、M38例、M44例、M53例、M62例)，急性淋巴细胞白血病(ALL)11例(其中L12例、L29例)，慢性粒细胞白血病急粒变1例，急性混合细胞白血病1例。男15例，女19例，年龄12～69岁，平均34岁。还观察了完全缓解患者4例和正常对照3名。34例AL根据临床病程阶段分为两组：初治组19例，复发组15例。根据AL疗效标准[4]在ALL化疗1个疗程和AML化疗2个疗程后进行疗效判断。完全缓解和部分缓解为有效，不缓解为无效。
2 RNA提取 全部病例均于化疗前采集骨髓涂片，并抽取骨髓3～4ml，肝素抗凝，Ficoll液分离单个核细胞。采用AGPC法[5]提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，－70℃冻存备用。
3 cDNA合成 反应体系50μl，内含总RNA10μg，AMV逆转录酶30U,RNA酶抑制剂40U,dNTP400μmol/L,随机引物500ng,5×逆转录缓冲液10μl。42℃孵育1小时,95℃水浴5分钟,将酶灭活后加双蒸水稀释1倍,－70℃冻存备用。
4 PCR反应 全部PCR引物由中国科学院微生物研究所基因工程中心合成。各引物序列如下：bcl-x(bcl-xL、bcl-xS)上游引物为5'-TTGGACAATGGACTGGTTGA-3',下游引物为5'-GTAGAGTGGATGGTCAGTG-3'（780bp或591bp）；bcl-2上游引物为5'-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3',下游引物为5'-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3'（318bp）；β2微球蛋白(β2-MG)上游引物为5'-AGTATGCCTGCCGTGTGAAC-3',下游引物为5'-AAGTTGCCAGCCCTCCTAGA-3' （306bp）。
PCR反应体系50μl,内含10×扩增缓冲液5μl,dNTP200μmol/L,两引物各0.25μmol/L,TaqDNA聚合酶2U,cDNA10μl。石蜡油40μl封住液面，置PTC-100型热循环仪上分别扩增β2-MG、bcl-x、bcl-2。反应条件:先94℃变性5分钟,然后进行扩增循环，包括变性1分钟（94℃）、退火1分钟（β2-MG50℃、bcl-x56℃、bcl-260℃）和延伸2分钟（72℃），β2MG、bcl-x、bcl-2分别为28，30，28个循环，最后72℃延伸5分钟。
5 PCR产物分析 bcl-x(bcl-xL、bcl-xS)、bcl-2和β2MG的扩增产物各10μl,在20g/L琼脂糖凝胶上进行电泳,88V,2小时。UVP紫外凝胶分析系统摄像，并于图像分析系统测定电泳图上对应的目的基因和内参照基因（β2-MG）PCR产物条带的吸光度(A)和面积，求其乘积，并分别计算bcl-xL、bcl-xS、bcl-2与β2MG的比值，反映相应目的基因mRNA转录本的含量。
6 统计学处理 全部数据经计算机SPSS软件处理，进行t检验、χ2检验和相关分析。
结果
1 RT-PCR的特异性 骨髓涂片光镜下白血病细胞占有核细胞的38.4％～99.6％(平均80.9％)。Ficoll液分离单个核细胞获1×107个细胞,采用AGPC一步法提取细胞总RNA，经紫外分光光度计测定各样品中RNA溶液A260/A280为1.8～2.0。总RNA经RNA酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察未发现有DNA存在。选表达恒定的结构蛋白β2MG基因作为内参照，各例均为阳性。在预实验中bcl-x引物扩增出特异的bcl-xL(780bp)和bcl-xS(591bp)二条亮带，对照组该位置没有亮带出现（图1）。扩增产物回收并稀释作为阳性对照，对照组产物作为阴性对照。同法获得bcl-2的阳性和阴性对照。
M：λDNA/HinⅢ标记物;1:阴性对照组；2，4：AL未缓解患者细胞；3：完全缓解患者细胞
图1 bcl-x(bcl-xL、bcl-xS)RTPCR结果
2 bcl-x和bcl-2mRNA转录本的表达 初治和复发组bcl-xL、bcl-xS、bcl-2基因mRNA转录本的表达和R值（bcl-xL/bcl-xS）如表1所示。在正常对照组,内参照基因呈阳性,3个目的基因在相应循环中未检测到PCR产物。完全缓解患者中仅见1例低度表达bcl-xL和bcl-2。在初治和复发组所有患者均可检测到各基因不同程度表达。复发组bcl-xL和bcl-2表达分别是初治组的1.8倍和1.9倍(P0.01)，并可见R值在复发组比初治组明显增高(P0.01)。
3 各基因的相关性分析 bcl-xL和bcl-2表达呈正相关(r=0.74，P＜0.01)。bcl-xL和bcl-xS的mRNA表达总体水平上也呈正相关（r="0.68，"P＜0.01)，但个体间有较大差异。
4 AL临床疗效与bcl-x和bcl-2基因表达的关系 31例可评定疗效的AL患者分为有效组和无效组,各基因表达如表2所示。结果显示bcl-2和bcl-xL的表达在治疗无效组分别是有效组的3.0倍和2.9倍（P〈0.01）,但bcl-xS的表达在两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。R值在治疗无效组比有效组明显增高（P〈0.01）。
表1 初治和复发组bcl-x和bcl-2mRNA表达的比较（
±s)
| 组别 |
例数 |
bcl-2 |
bcl-xL |
bcl-xS |
R(bcl-xL/bcl-xS) |
| 复发 |
15 |
0.64±0.34 |
0.51±0.21 |
0.30±0.19 |
2.43±1.25 |
| 初治 |
19 |
0.33±0.28 |
0.28±0.25 |
0.24±0.21 |
1.22±0.45 |
| P值 |
|
＜0.01 |
＜0.01 |
＞0.05 |
＜0.01 |
表2 不同疗效组bcl-x和bcl-2mRNA表达(±s)
| 组别 |
例数 |
bcl-2 |
bcl-xL |
bcl-xS |
R(bcl-xL/bcl-xS) |
| 无效 |
14 |
0.76±0.27 |
0.57±0.16 |
0.34±0.16 |
2.35±0.85 |
| 有效 |
17 |
0.25±0.21 |
0.20±0.20 |
0.21±0.29 |
1.18±0.60 |
| P值 |
|
〈0.01 |
〈0.01 |
＞0.05 |
〈0.01 |
5 bcl-xL和bcl-2高度表达与临床疗效的关系 在本研究条件下选取bcl-xL≥0.50和bcl-2≥0.60为高度表达。不同组别的临床疗效如表3所示。
在可判断疗效的31例AL患者中，bcl-xL或bcl-2高表达患者的治疗无效率比非高表达患者明显增高(P〈0.01),bcl-xL和bcl-2同时高表达的10例患者全部治疗无效。用bcl-xL≥0.50和bcl-2≥0.60作为高度表达的标准,判断二基因高表达与临床疗效的关系有较好的一致性。
表3 bcl-xL和bcl-2高度表达与临床疗效的关系
| 组别 |
总例数 |
无效例数 |
无效率(％) |
P值 |
| bcl-xL |
|
|
|
|
| 高表达组 |
15 |
12 |
80.0 |
|
| 非高表达组 |
16 |
2 |
12.5 |
〈0.01 |
| bcl-2 |
|
|
|
|
| 高表达组 |
12 |
11 |
91.7 |
|
| 非高表达组 |
19 |
3 |
15.8 |
〈0.01 |
| 同时高表达组 |
10 |
10 |
100.0 |
|
| 同时低表达组 |
14 |
1 |
7.1 |
〈0.01 |
讨论
为了保证RTPCR产物的特异性，我们应用的bcl-x引物为bcl-xL和bcl-xS的共有序列，位于bcl-xS的5'端和3'端不翻译区域的两个不同的外显子中，因此任何污染的基因组DNA的PCR产物将大于其mRNA的产物[2]。各PCR体系设置阳性和阴性对照，并选择在多种组织中表达恒定,且具有膜表面依赖行为的结构蛋白β2MG基因作内参照，β2MG的扩增产物为306bp[6]，各例标本均为阳性。bcl-xL、bcl-xS和bcl-2扩增的特异性产物为780bp、591bp和318bp[2，6，7]，并通过目的基因与β2MG产物的比值，获得可靠的定量信息。
细胞凋亡调控是多基因参与的复杂网络系统,bcl-2基因家族是重要的凋亡调控基因,其中bcl-xL和bcl-2具有抑制凋亡的作用，基因转染的研究已证明它们能抑制多种凋亡诱导因素介导的细胞凋亡，处于凋亡调控的终末部分[1，2]。尽管二基因表达的确切调控机制还不清楚，但发现bcl-xL在多种肿瘤细胞系中高表达，而且bcl-2也在多种肿瘤研究中显示类似结果，例如B细胞系慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌等均检测到bcl-2的异常表达[1，8，9]。在本实验中，AL细胞普遍表达bcl-xL和bcl-2基因，比完全缓解组和正常对照组骨髓细胞的表达明显增高（P〈0.01），使AL细胞有可能在体内长期存活并呈蓄积性增加，提示AL的发病可能与抑制凋亡基因的高表达有关。促凋亡基因bcl-xS未发现与AL的复发和疗效有关，提示在AL的发生和发展中bcl-xL处于优势地位，bcl-xS的表达增高可能是bcl-x基因不同剪接机制[2]的伴随现象。既往研究证明bcl-xL和bcl-2基因的表达具有组织和阶段特异性，各自独立地抑制凋亡的发生[2，10]，在本实验中它们的表达呈正相关(r="0.74,P＜"0.01)，提示它们在AL细胞中可能通过不同的转录激活途径而启动基因表达,各自具有独立的临床意义,同时检测意义更大。
在体外实验研究中，基因转染bcl-xL和bcl-2均可介导多药耐药（MDR）表型，引起MDR的机制是抑制化疗和放疗导致的肿瘤细胞凋亡[3，11]。我们的实验结果显示，bcl-xL和bcl-2在治疗无效组的表达比治疗有效组的表达显著增高（P〈0.01），同时在实验中还观察到bcl-xL和bcl-2的表达在复发组分别是初治组的1.8倍和1.9倍(P〈0.01),提示AL的化疗敏感性与抑制凋亡基因的异常表达有关，它们的表达增高是AL患者复发的高危因素。我们把bcl-xL和bcl-2的表达≥0.50和≥0.60定为高度表达。分析高度表达与临床疗效的关系显示，bcl-xL和bcl-2高度表达的患者治疗无效率分别为80.0％和91.7％，比非高度表达组治疗无效率明显增高（P〈0.01）。bcl-xL和bcl-2同时高表达时，治疗无效率为100.0％。可见本标准判断临床疗效有较好的一致性，可作为AL预后的监测指标及指导制定化疗策略和方案的客观依据。
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收稿：1998-11-10修回：1999-03-09
校对：张志方
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