免疫磁珠与激活的单核-巨噬细胞对白血病细胞体外净化作用的研究

中华血液学杂志 1999年第6期第20卷 研究报告

作者：宋振岚　董学斌　安广宇　练诗梅　富丽　慕俐君　董海东　钱振超

单位：116027　大连医科大学第二临床学院血液内科(宋振岚、董学斌、安广宇、练诗梅、富丽、慕俐君)；大连医科大学病理生理教研室(董海东、钱振超)

　　已知激活的单核-巨噬细胞(MΦ)能选择性消除残存的肿瘤细胞,在抗复发、抗转移诸方面具重要价值。我们用免疫磁珠与分别经凝集素美洲商陆(PWM)+IL-2及新城鸡瘟病毒(NDV)激活的MΦ对18例急性白血病的骨髓或外周血进行体外净化,效果明显,现报告如下。

　　材料和方法

　　1　临床资料与取材　首发或复发的急性非淋巴细胞白血病(ANLL)11例,男7例,女4例;急性淋巴细胞白血病(ALL)7例,男2例,女5例。年龄18～52岁,平均40岁。外周血白血病细胞比例为0.7以上者,取外周血5ml;＜0.7者,取骨髓3～5ml,分离单个核细胞(MNC)。

　　2　材料　免疫磁珠及对应的单克隆抗体(单抗)及IL-2,由日本冈山大学近土柞子惠赠。PWM为Sigma生产,MTT购自Chemicao,NDV由本校微生物教研室提供,TNF-α试剂盒由北京华美公司提供。

　　3　MΦ的制备　正常人肝素抗凝外周血20ml制成2×10⁶/ml的MNC悬液,置37℃,体积分数为5% CO₂饱和湿度下贴壁2小时,收集贴壁细胞。用含体积分数为10%的马血清的RPMI 1640液调所需细胞浓度。

　　4　免疫磁珠清除骨髓或外周血中的白血病细胞　先用单抗测定各例白血病细胞的分化表型,以2×10⁸/ml白血病细胞悬液加入相应的单抗,4℃30分钟,加入对应的免疫磁珠按说明规定的时间放入磁场,将没被吸附的MNC吸到试管内,计数细胞数,与吸附前比较,求出被吸附的白血病细胞数,为研究的净化效果。

　　5　PWM+IL-2、NDV激活的MΦ的细胞毒作用及上清TNF-α含量测定　收集的MΦ分别与PWM+IL-2(终浓度分别为10μg/ml和3000U/ml)及NDV(100活性单位)培养一定时间,加入靶细胞(效∶靶=20∶1)作用48小时,按常规MTT法测定吸光度(A)值。按TNF-α试剂盒说明测定上清内TNF-α含量。未经激活的MΦ为对照组,细胞毒活性依据下列公式计算其抑制率:

细胞毒活性(%)=［1-(A-B)/C］×100%

　　其中A=(靶细胞+MΦ)的A值;B=MΦ的A值;C=靶细胞的A值。

　　6　激活的MΦ对白血病细胞净化效果判定　体外以CFU-L及CFU-GME集落产率判定。

　　6.1　净化前后的CFU-L集落培养：净化前各例行CFU-L集落培养^［1］,同时将激活的MΦ以20∶1效靶比与白血病细胞(终浓度2×10⁵/ml)孵育一定时间,收集非贴壁细胞,再行CFU-L集落培养,判定净化效果^［1］。

　　6.2　MΦ作用前后的白血病骨髓CFU-GME集落培养:将2×10⁵/ml浓度MNC接种于终浓度:体积分数为30%胎牛血清,0.1g/ml GM-CSF,2U/ml Epo,10^-4mol/L 2-ME的甲基纤维素培养体系内14天,计数CFU-GME集落数(平均每个平皿中CFU-G,CFU-M,CFU-E及CFU-mix集落的总和为观察的集落数,每个集落均由40个以上细胞组成),判定净化效果。

　　7　两种方法激活的MΦ与白血病细胞一起培养2，6，12，24小时,吸取不贴壁细胞,PBS洗涤2次,按常规方法行光镜、电镜及DNA电泳,观察有无细胞凋亡现象。

　　结　果

　　1　免疫磁珠吸附法对白血病细胞的清除效果　2×10⁸白血病细胞经免疫磁珠吸附后,没被吸附的白血病细胞均值为(1.2±0.5)×10⁵/ml,净化效果约为2～3个对数级。

　　2　两种诱导剂激活的MΦ对两类白血病细胞的细胞毒活性　结果见表1。CFU-L产率激活组与未激活组差异有显著性(P＜0.01)，激活组与未激活组CFU-GME产率差异有显著性(P＜0.01),不同诱导剂间差异无显著性(P＞0.05)。

　　3　免疫磁珠净化前后CFU-L及CFU-GME集落产率　结果见表2。

表1　两种诱导剂激活的MΦ对白血病细胞的细胞毒活性(%，±s)

　　注：ANLL组:①与②、③比较， P＜0.01；②与③比较， P＞0.05; ALL组:①与②、③比较， P＜0.01；②与③比较， P＞0.05;ANLL与ALL细胞类型间比较， P＞0.05

　　表2　净化前后MNC的CFU-L及CFU-GME产率(/2×10⁵细胞，±s)

　　注：ANLL的例数为11，ALL的例数为7

　　4　两种诱导剂激活的MΦ对白血病细胞形态的影响　两种诱导剂激活的MΦ作用于白血病细胞后,光镜下可见核染色质变粗,核固缩,染色质浓集及碎裂成核小体,细胞膜完整,轮廓清楚,核碎裂小体突向细胞膜,形成膜包被的致密小体,24小时胞浆空泡变性逐渐增多。电镜下,可见白血病细胞有胞浆浓缩,核糖体尚存,核碎裂,并可见凋亡小体。

　　5　DNA电泳结果　经PWM+IL-2激活的MΦ作用的白血病细胞,未见典型梯形电泳带。

　　6　激活的MΦ对细胞分泌TNF-α的影响　未激活的MΦ组作用于白血病细胞后,其上清的TNF-α含量,ANLL为(18.2±1.4)pg/ml,ALL为(22.7±0.3)pg/ml。PWM+IL-2激活组,ANLL为(63.1±1.3)pg/ml,ALL为(48.1±1.7)pg/ml。NDV激活组,ANLL为(65.2±1.8)pg/ml,ALL为(46.9±1.5)pg/ml。未激活与激活组差异有显著性,虽PWM+IL-2组TNF-α值高于NDV组,但二组间差异无显著性,白血病类型间差异亦不显著。

　　讨论

　　白血病细胞体外净化是自体干细胞移植急需解决的问题。多年来,人们用多种方法净化白血病患者自体骨髓或外周血,但始终未找到一种简便、高效的方法。我们采用免疫磁珠与激活的MΦ对18例急性白血病骨髓或外周血进行净化作用的研究发现,体外免疫磁珠可净化2～3个对数级的白血病细胞,这是一种快速、简便、稳定的净化方法。

　　我们曾转输TNF-α、IL-2激活的MΦ治疗小鼠白血病(L615),延长了平均存活期,结合化疗可使20%晚期小鼠得以治愈^［2］,但对人的白血病研究尚未见报道。根据CFU-L可代表白血病细胞中＜1%的克隆细胞群,我们用此方法发现两种诱导剂激活的MΦ均可使CFU-L抑制率达100%,激活的MΦ可使CFU-GME集落形成能力恢复良好,证实激活的MΦ对肿瘤细胞有选择性,而不影响正常造血祖细胞的集落形成。测定激活的MΦ作用于白血病细胞,其上清液内的TNF-α含量明显增加,与白血病类型间差异不显著(P＞0.05),这与以往的报道一致。TNF-α的增高,主要是被激活的MΦ产生的,也与白血病细胞自分泌有关。NDV能激活MΦ,净化白血病细胞,主要与诱导其产生TNF-α和INF等细胞因子,发挥其细胞非特异性抗肿瘤作用有关^［3］。激活的MΦ不但有直接细胞毒作用,而且发现能诱导白血病细胞凋亡。推测这与PWM刺激单核细胞产生TNF等细胞因子及其它效应因子,参与靶细胞的凋亡有关。

　　免疫磁珠与激活的MΦ对骨髓和外周血白血病细胞具有确切的净化作用,也是用于防止移植后复发的过继免疫治疗的新途径。临床应用效果与体外实验结果能否一致，还需进行进一步的研究。参考文献

　　［1］　达万明.残存白血病细胞的检测和治疗.中华血液学杂志,1989,10:159-161.

　　［2］　董海东,钱振超.rTNF或rIL-2激活的巨噬细胞体内外抗肿瘤作用.上海免疫学杂志,1991,11:264-267.

　　［3］　张宏宇,白莲花,刘学仁.新城鸡瘟病毒修饰的同种肿瘤细胞对肿瘤转移免疫防治效应.中华微生物学和免疫学杂志,1995,15:19.

收稿：1998-02-25

　　修回：1998-11-10