川芎嗪对白血病HL-60/VCR细胞多药耐药的逆转及其机制研究

中华血液学杂志 1999年第6期第20卷 研究报告

作者：梁蓉　杨平地　陈协群　白庆咸　黄高升

单位：710033　西安，第四军医大学西京医院

　　多药耐药(MDR)的产生是造成难治性白血病的主要原因，因此逆转白血病MDR已成为提高白血病化疗疗效的一种重要手段。目前用于临床的逆转剂主要有环孢霉素A(CsA)和维拉帕米(VP)等，但其毒性相对较大，许多患者难于耐受。据此，我们采用低毒、价廉的中药钙通道阻滞剂川芎嗪(TMP)为MDR逆转剂，研究其对白血病MDR细胞系HL-60/VCR的逆转作用和机制。

　　材料和方法

　　1　细胞株　HL-60细胞株为中国科学院上海细胞生物研究所提供；HL-60/VCR细胞株为长春新碱(VCR)耐药株，引自美国纽约 Sloan-Kettering肿瘤中心，无VCR培养2周后取对数生长期细胞进行实验。

　　2　试剂　TMP购自北京第四制药厂，鼠抗人P170单抗和兔抗人Bcl-x多抗均购自Santa Cruz公司，羊抗鼠（兔）IgG-HRP及RT-PCR反应试剂等均购自华美生物制品公司。

　　3　体外药敏试验　采用常规MTT法，以细胞存活率为纵坐标，化疗药物浓度的对数为横坐标，绘制剂量效应曲线，并求IC₅₀（半数细胞抑制剂量）值。

　　4　耐药逆转实验设计　实验分为6组，对照组为未加药的空白孔，给药组分为化疗药物组、TMP组、VP组、TMP+化疗药物组、VP+化疗药物组。耐药指标为耐药倍数（耐药细胞IC₅₀值/亲本细胞IC₅₀值）；逆转指标采用逆转倍数（逆转前IC₅₀值/逆转后IC₅₀值）及相对逆转效率［（逆转前IC₅₀值-逆转后IC₅₀值）/（逆转前IC₅₀值-亲本IC₅₀值）×100%］，后者考虑了化疗药物对亲本细胞IC₅₀值的影响，可能更为准确客观^［1］。

　　5　RT-PCR检测mdr1 mRNA　采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取各组细胞的总RNA，引物由军事医学科学院基础医学研究所合成。用于特异性地扩增mdr1基因序列的正义链引物为CCCATCATTGCAATAGCAGG，反义链引物为GTTCAAACTTCTGCTCCTGA，用于特异性扩增内对照β₂-微球蛋白基因序列的正义链引物为ACCCCCACTGAAAAAGATGA，反义链引物为ATCTTCAAACCTCCATGATG^［2］。先逆转录cDNA，然后在每个PCR反应管中加入cDNA混合物80ng，2对引物各20μmol/L，Taq酶5U，反应体系100μl，94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸60秒，共30周期。扩增结束后取扩增产物电泳，在紫外灯下观察分析结果。

　　6　Western blot法　检测P170和Bcl-x蛋白按文献［3］方法，采用紫外分光光度仪进行电泳上样前蛋白质定量，最后显色结果用薄层扫描定量。

　　7　激光共聚焦显微镜下测定细胞内罗丹明(Rh123)的荧光强度　收集各组对数生长期细胞，调整浓度为2×10⁸/L，TMP组加入320mg/L TMP 60分钟后，各组再加入10mg/L Rh123，按文献［4,5］的方法测定Rh123的荧光强度，最后用图象处理软件进行定量。

　　8　统计学处理　采用t检验和方差分析。

　　结果

　　1　HL-60/VCR细胞多药耐药的逆转　HL-60/VCR细胞的耐药谱见表1。

　　1.1　确定TMP的非细胞毒性剂量：当TMP＞320mg/L时，对HL-60/VCR细胞有生长抑制作用，并呈浓度依赖性；当TMP≤320mg/L时，上述抑制作用消失，细胞存活率＞95%。本实验采用100，320mg/L为TMP逆转剂量。

　　1.2　TMP对HL-60/VCR细胞多药耐药的部分逆转：加入100mg/L或320mg/L TMP后，HL-60/VCR细胞对各种化疗药物的IC₅₀值有所下降，并呈浓度依赖性(见表2)。不同的化疗药物，不同药物的耐药倍数导致逆转效率不同，TMP对VCR的逆转效果较好，对DNR最差。

　　1.3　TMP和VP对HL-60/VCR细胞多药耐药逆转的比较：320mg/L TMP及0.32，1.00mg/L VP分别与VCR联合应用，从图1可以看出VP和TMP均能增加HL-60/VCR细胞对VCR的敏感性，增敏效果为1.00mg/L VP＞320mg/L TMP＞0.32mg/L VP。

图1　TMP和VP逆转HL-60/VCR细胞耐药性的比较

　　1.4　TMP对HL-60/VCR细胞内Rh123荧光强度的影响：HL-60细胞的Rh123荧光弥散分布于整个胞浆，而HL-60/VCR细胞中Rh123点状分布于胞膜周边，且荧光强度明显比前者弱，加入TMP320mg/L后，结合细胞内Rh123荧光强度定量分析可以看出，HL-60/VCR细胞荧光强度明显增高。定量结果显示，HL-60细胞荧光强度为119.1±108.7; HL-60/VCR细胞荧光强度为27.8±20.3;经TMP逆转后的HL-60/

表1　HL-60细胞及其耐药细胞株HL-60/VCR对化疗药物的IC₅₀值(ng/ml)和耐药倍数

　　注：VBL：长春花碱；HHT：高三尖杉酯碱；Vp16：足叶乙甙；ADM：阿霉素；DNR：柔红霉素

表2　不同浓度(mg/L)TMP对HL-60/VCR细胞多药耐药的逆转作用

化疗药物	IC50(mg/L,±s)			逆转倍数		相对逆转效率(%，±s)
	0	100	320	100	320	100	320

　　注：*与未加TMP组比较，P＜0.05；#与未加TMP组和100mg/L TMP组比较，P＜0.05VCR细胞为56.6±45.7。表明HL-60/VCR细胞内Rh123的蓄积明显小于HL-60细胞，而TMP处理后，HL-60/VCR细胞内Rh123荧光明显增强（P＜0.05）。

　　2　TMP逆转耐药的作用机制　

　　2.1　mdr1 mRNA的表达　HL-60敏感细胞表达阴性，HL-60/VCR耐药细胞表达阳性。

　　2.2　TMP对P170糖蛋白表达调控　Western blot显示：HL-60/VCR细胞中P170强表达，经320mg/L TMP处理72小时后，P170表达下调。薄层扫描显示TMP处理前后P170蛋白印迹带的吸光度(A)值分别为9109.76和3396.08。

　　2.3　TMP对抗凋亡Bcl-x_L蛋白表达的调控　Western blot证实HL-60和HL-60/VCR细胞均表达Bcl-x_L（相对分子质量为29×10³），前者为弱阳性，后者为强阳性；HL-60/VCR细胞经320mg/L TMP处理72小时后，其Bcl-x_L蛋白的表达降低。薄层扫描结果：HL-60细胞和处理前后的HL-60/VCR细胞Bcl-x_L蛋白印迹带的A值分别为11759.18，28639.45，15093.08，HL-60/VCR细胞的Bcl-x_L表达是HL-60细胞的2.4倍，而TMP使HL-60/VCR细胞Bcl-x_L表达降低了47%。

　　讨论

　　TMP为中药川芎的有效成分之一，具有钙通道阻滞活性，临床主要用于心脑血管疾病等。近年来发现它可部分纠正阿霉素对小鼠腹水癌的抗药性^［6］。为进一步证实TMP是否具有对人白血病MDR逆转效应，我们在体外采用HL-60/VCR为靶细胞，发现TMP在100～320mg/ml的非细胞毒性浓度范围内，确能增加HL-60/VCR细胞对多种化疗药物的药物敏感性，其逆转效果除了具有TMP剂量依赖性外，尚与化疗药物种类有关。与VP相比，对VCR的增敏效果为1.00mg/L VP＞320mg/L TMP＞0.32mg/L VP。但在体内能否达到体外的逆转效果，尚待进一步研究。

　　本研究显示HL-60/VCR细胞内的Rh123荧光强度明显小于HL-60细胞，而TMP逆转HL-60/VCR细胞MDR过程中伴有细胞内的Rh123荧光强度的增加。对逆转机制研究发现TMP能下调P170蛋白的表达，这提示TMP是通过降低HL-60/VCR细胞膜P170蛋白表达，影响其生物学功能，达到逆转白血病MDR。

　　目前研究认为细胞凋亡抑制亦可能是肿瘤耐药的主要机制之一，且凋亡有关基因Bcl-2与MDR形成的关系已得到肯定。Bcl-x与Bcl-2有73%的氨基酸同源性，因剪接方式不同，其表达产物有长短两种蛋白Bcl-x_L和Bcl-x_S，前者有233～241个氨基酸，抑制细胞凋亡；后者较前者少63个氨基酸，功能相反^［7］。本实验结果显示，HL-60/VCR细胞Bcl-x_L的表达明显强于亲本HL-60细胞，前者是后者的2.4倍，提示Bcl-x_L的高表达与人白血病MDR的形成可能有一定的关系。我们还发现TMP不仅能下调P170蛋白，还可以轻度降低Bcl-x_L的表达，提示TMP逆转白血病MDR的机制具有异质性。

　　本课题受陕西省自然科学研究计划项目基金(97SM53)资助

　　参考文献

　　［1］　Yang JM,Goldenberg S,Gottesman MM, et al. Characteristics of P388/VMDRC.04, a simple sensitive model for studying P-glycoprotein antagonists. Cancer Res, 1994，54:730-737.

　　［2］　Chen CJ,Chin JE,Ueda K,et al. Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdr1(P-glycoprotein) gene from multidrug resistant human cells. Cell,1986，47:381-383.

　　［3］　Sambrook J,Fritsch EF,Naniatis T, et al. Molecular cloning. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989. 888-897.

　　［4］　Lautier D,Bailly JD,Demur C,et al. Altered intracellular distribution of daunorubicin in immature acute myeloid leukemia cells. Int J Cancer,1997，71:292-299.

　　［5］　Marks DC, Su GMI,Davey RA,et al. Extanded multidrug resistance in haemopoietic cells. Br J Haematol,1996，95:587-595.

　　［6］　胡艳平，刘健，王庆端，等. 川芎嗪和维拉帕米纠正阿霉素对小鼠腹水癌的抗药性. 药学学报，1993，28:75-78.

　　［7］　Yang E,Korsmeyer JS. Molecular thanatopsis: a discourse on the bcl-2 family and cell death.Blood,1996，88:386-401.

收稿：1998-04-23

　　修回：1998-08-30