急性髓系白血病细胞尿激酶受体表达及其意义

中华血液学杂志 1999年第1期第20卷 研究报告

作者：徐杰　奚晓东　王爱青　白霞　陆长明　陈黎　朱明清　耿美菊　陆核　阮长耿

单位：215006　苏州医学院附属第一医院、江苏省血液研究所

　　许多恶性肿瘤细胞有尿激酶受体(Urokinase receptor,uPAR CD₈₇)高表达，并参与其浸润、转移等过程。进一步研究表明，uPAR还参与肿瘤细胞的增殖、分化和信号传导等^［1］。近几年来的研究表明，部分白血病细胞也有uPAR的表达^［2］。我们用流式细胞术检测了93例成人急性髓系白血病uPAR表达，并分析了uPAR表达与临床表现及预后的关系。另外，还检测了不同的白血病细胞株在诱导分化过程中的uPAR表达的改变。

　　材料和方法

　　1　临床资料　急性髓系白血病93例均为本院确诊的初治患者。男58例，女35例，年龄15～69岁，按FAB分型：M₁11例，M₂ 40例，M₃ 16例，M₄ 9例，M₅15例，M₆ 2例；急性淋巴细胞白血病患者30例中L₁20例，L₂ 7例，L₃ 3例。

　　2　主要试剂和材料　uPAR单抗为America Diagnostic公司产品。FITC-羊抗鼠单抗为邦定公司产品。RPMI1640为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青生物制品公司产品。氟波酯(PMA)为Sigma公司产品，以无水乙醇配制成浓度为10μg/ml的贮存液，置-20℃保存。

　　3　流式细胞术检测方法　取骨髓用淋巴细胞分离液，常规分离制备单个核细胞悬液。0.01mol/L pBS洗涤，台盼蓝活细胞计数＞0.95。10%兔血清孵育30分钟以封闭Fc受体。取2×10⁶/ml细胞悬液

　　100μl，加uPAR单抗20μl(1∶50稀释)，室温孵育30分钟，阴性对照加鼠IgG，经PBS洗涤后，加FITC-羊抗鼠二抗20μl(1∶10稀释)，室温下避光30分钟，经PBS洗涤后流式细胞仪(Coulter公司，Epics xL型)检测。每例检测5000～10000个细胞，阳性判断标准为荧光阳性细胞＞20%。培养白血病细胞株不经淋巴细胞分离液分离，余检测步骤相同。

　　4　白血病细胞株的诱导分化　白血病细胞株HL-60，U937，K562细胞由本所细胞生物学室提供，悬浮于RPMI1640培养液(含15%胎牛血清)，分别加入PMA终浓度为30ng/ml。细胞起始密度为2×10⁵/ml，置37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱，培养5天，分别于1，3，5天，取部分细胞观察细胞形态改变、硝基四氮唑蓝(NBT)还原反应，并用流式细胞术检测其uPAR表达的改变。

　　5　细胞形态观察及NBT还原试验　U937、K562、HL-60细胞经PMA作用1，3，5天后取部分培养细胞涂片，Wright’s染色，光镜下观察形态。部分培养细胞悬液加入等量0.2% nBT Hank’s液(无Ca^2＋，Mg^2＋)混匀后，37℃孵育30分钟离心制片，Wright’s染色，计数200个细胞中阳性细胞数。

　　6　统计学检验　采用t及χ²检验。

　　结果

　　1　临床病例uPAR表达检测　11例M₁中2例表达阳性(18%)，40例M₂中20例表达阳性(50%)，16例M₃中11例阳性(68.7%)，9例M₄中6例阳性，15例M₅中13例阳性(86.7%)，2例M₆及30例 aLL均为阴性。

　　2　髓系白血病uPAR表达与临床表现及预后的关系　见表1。

表1　uPAR表达与临床表现预后的关系

　　3　U937，HL-60，K562细胞经PMA作用5天后，大部分成为贴壁细胞，形态向单核-巨噬细胞转变。NBT还原率的改变见图1。HL-60，K562细胞uPAR表达改变见图2。U937细胞在未经PMA作用前即已有(92.5±4.2)%的阳性表达率，故作用主要表现为荧光强度的改变，见图3。

图1　PMA诱导后NBT还原率的改变图2　PMA诱导后uPAR表达的改变

图3　PMA诱导后U937细胞uPAR表达荧光强度的改变

　　讨论

　　Plesner等^［2］检测了27例急性髓系白血病，其中12例(44.4%)为阳性表达，在ALL未见uPAR表达。本组93例急性髓系白血病中52例(55.9%)uPAR表达阳性，而30例急性淋巴细胞白血病均为阴性表达。说明uPAR可作为急性白血病细胞分型的指标之一。

　　Plesner等^［2］的结果表明M₅多见uPAR的表达，而M₅往往有肝、脾、皮肤、粘膜等髓外组织浸润表现。因此，推测白血病细胞uPAR表达与其脱离骨髓进入外周血循环以及对髓外组织的浸润有关。本研究结果表明，uPAR表达阳性组发生髓外浸润的比例及外周血白细胞数明显高于uPAR表达阴性组，uPAR阳性组的CR率明显低于阴性组。因此，uPAR表达与髓系白血病的临床表现，生物学特性有关，可作为判断预后的指标之一。另外，Frade^［3］曾报道在急性髓系白血病患者血浆尿激酶增高与出血倾向有关。本研究结果表明白血病细胞由于uPAR与出血无明显关系。说明白血病细胞由于表达uPAR而使其细胞表面纤溶活性增高主要与其浸润能力有关。

　　本研究结果表明，U937、HL-60、K562细胞经PMA诱导分化后uPAR表达增加，而且与分化程度成正比。说明uPAR可作为髓系白血病细胞诱导分化较好的指标。另外，Nustrat等^［4］的研究表明，在PMA诱导HL-60细胞分化过程中，uPA可促进其分化，而uPA单抗可抑制PMA的诱导分化作用。因此，uPAR在诱导细胞分化过程中的作用，尚有待进一步的研究。

　　　　本课题受国家教委留学回国人员科研基金(96-644)及苏州医学院青年科技基金资助

　　参考文献

　　[1]　Dan Ф K, Behrendt N, brunner N, et al. The urokinase receptor: protein structure and role in plasminogen activation and cancer invasion. Fibrinolysis, 1994, 8:189-203.

　　[2]　Plesner T, Ralfkiaer E, Wittrup M, et al. Expression of the receptor for urokinase-type plasminogen activation in normal and neoplastic blood cells and hematopoietic tissue. Am J Clin Pathol, 1994, 102:835-841.

　　[3]　Frade LJG, Sureda A, Torrado MC, et al. High plasma urokinase-type plasminogen activator levels are present in patients with acute nonlymphoblastic leukemia. Acta Haemotol, 1992;88:7-10.

　　[4]　Nusrat AR, Harold A, Chapman JR. An autocrine role for urokinase in phorbol ester-mediated differentiation of myeloid cell lines. J Clin Invest,1991, 87:1091-1097.

收稿：1998-02-02　　修回：1998-05-11(校对：张吉贤)