鼠乳腺癌细胞SX-9放射敏感性与细胞周期研究
中华放射肿瘤学杂志 2000年第2期第9卷 论 著
作者：江国春 袁丽珍 魏康 郭学敏 张雪峰
单位：北京，中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所实验血液学研究室 100850
关键词：SX-9细胞；放射敏感性；细胞周期；p53基因；细胞死亡
【摘要】 目的 通过对小鼠乳腺癌放射敏感细胞SX-9照射前、后细胞周期分布及其p53基因状态等研究，初步探讨其放射敏感性与照射后细胞周期阻滞的关系。方法 利用克隆形成法比较SX-9与SR-1细胞照射后细胞存活份数及流式细胞术研究其细胞周期分布的差异；RT-PCR克隆并鉴定p53基因；DNA电泳、流式细胞术和苔盼蓝染色研究细胞死亡方式。结果 SX-9细胞对γ射线高度敏感，照射后G1期阻滞消失，但仍存在G2期阻滞；其p53基因第5外显子存在突变，DNA电泳检测不到DNA ladder；苔盼蓝染色检测到的细胞死亡比例与对照组无显著差异。结论 γ射线照射放射敏感细胞SX-9细胞周期改变与其亲本细胞SR-1明显不同。SX-9亲本细胞SR-1细胞存在G1，G2期阻滞。DNA电泳及苔盼蓝染色检测结果与SX-9细胞相同。结果表明SX-9细胞对放射敏感不是由于照射后细胞凋亡所致，而是由于其失去增殖能力引起增殖死亡的结果。
Cell cycle distribution and radiosensitivity of mouse mammary carcinoma derived cell line SX-9
JIANG Guochun YUAN Lizhen WEI Kang et al
（Laboratory of Hematology,Institute of Radiation Medicine,The PLA Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850，China）
【Abstract】 Objective To investigate cell cycle distribution of radiosensitive cell line SX-9 after X-ray irradiation and the relationship between radiosensitivity and cell cycle distribution. Methods The survival fraction of SX-9 to SR-1 was compared with clonegenic assay，cell cycle distribution and p53 gene status were investigated with FCM and RT-PCR respectively. Results SX-9 is radiosensitive compared with its parental cell line SR-1. Because of its p53 mutation in exson 5，only G2 arrest was found in SX-9 cell line .Apoptosis was not observed in either of these two cell lines after DNA electrophoresis，flow cytometry and trypan blue staining. Conclusions Irradiation of serum-starved synchronous cells show a prolonged delay in G2 for radiosensitive cell line SX-9 and in G1 and G2 for its parental cell line SR-1，whereas no differences are found in DNA electrophoresis，flow cytometry and trypan blue staining between these two cell lines. It implicates the deficiency in the rejoining of DNA DSB during G2-phase delay as a possible cause for its radiosensitivity，although the mechanism is not fully understood.
【Key words】 SX-9 cell; Radiosensitivity; Cell cycle ; p53 gene; Cell death
细胞放射敏感性的改变涉及多种分子生物学过程其中也包括细胞周期的改变［1］。放射导致哺乳动物细胞DNA损伤，将激活细胞内细胞周期监控机制，即各种限制点（checkpionts），使细胞停留于细胞周期的特定阶段，从而对损伤的DNA进行修复，以保证细胞基因组的完整性［2］ 。本研究选择同一来源而放射敏感性差异明显的一对细胞进行研究。通过对其照射后活存份数、细胞周期改变、p53基因状态以及细胞死亡的研究，探讨SX-9细胞的放射敏感性与细胞周期改变的关系。
1 材料与方法
1.1 细胞株：SX-9，SR-1小鼠乳腺癌细胞由日本放射线研究所佐藤弘毅教授惠赠。
1.2 细胞培养：SX-9和SR-1细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中37℃，5% CO2、饱和湿度培养。
1.3 细胞存活份数测定：取对数生长期细胞，不同剂量（SX-9细胞：0.0、0.5、1.0、2.0、4.0Gy；SR-1细胞0、2、4、6、8、10Gy）的60Co γ射线照射后，接种于甲基纤维素半固体培养基中；37℃，5%CO2培养7～14 d后，计算细胞克隆数，不同剂量组的克隆形成率（克隆数/接种细胞数×100%）与0Gy组相除得出存活份数。
1.4 细胞周期测定（见文献［3］） ：
1.4.1 细胞制备：细胞制成单细胞悬液后，800～1000r/min离心5min， 400目筛网过滤2次；70%乙醇固定，4℃保存。染色前用PBS离心沉淀去除固定液，400目筛网过滤。
1.4.2 染色： 加终浓度为150mg/L RNA酶，37℃水浴30min后移入冰浴中停止酶反应，再加入终浓度为5mg/L碘化丙啶（PI）染色液，4℃避光30min。
1.4.3 测试：美国Becton-Dickinson公司FACScalibur型流式细胞仪，氩离子激光器，激光器输出功率15mW，激发光波长488nm。每个样品测试1×104个细胞，数据获取用CELLQuest软件，分析细胞周期用ModFit 2.0。
1.5 细胞总RNA提取：对数生长期细胞离心弃培养基、PBS洗涤后，用Promage总RNA提取试剂盒提取，RNA溶于300μL无RNase水中，定量后－20℃贮存。
1.6 RT-PCR克隆p53基因cDNA：根据文献［4］提供的序列，由国际互联网提供的PCR引物设计软件设计，并由Sybersyn公司（USA）合成如下：
上游引物：5'-CGAAGACTGGATGACTGCC-3' ；
下游引物：5'-TCAGTCTGAGTCAGGCCCCA-3'。
在0.5mL离心管中加入总RNA 约1μg ，逆转录酶缓冲液2μL，RNA酶抑制剂 1μL ，Oligo（dT）15～18 1μL， 逆转录酶0.5μL，双蒸水加至20μL配成PCR混合体系；42℃水浴1.5h，95℃变性5min，－20℃贮存。p53基因编码区的PCR扩增：取5μL逆转录cDNA，加入20μL PCR 混合体系，1 U Taq酶，2滴石蜡油，离心数秒；PCR扩增35个循环：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃30s，后取5μL产物至1%的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察（p53基因编码区DNA PCR扩增片段长约1 100bp）。全序列测定由日本六和通（Takara）公司协助完成。
1.7 基因组DNA的提取和电泳：对数生长期细胞，经离心、PBS洗涤后计数，加入100μL细胞裂解液［50mmol/L KCl，10mmol/L Tris HCl (pH8.3)，2.5mmol/L MgCl2，0.1mg明胶，0.45%NP-40，0.45% Tween 20］混匀;再加入2μL蛋白酶K（10mg/L），50℃～60℃水浴1～2h(其间混匀2～3次);加入100μL酚、氯仿、异戊醇混合液（25：24：1），混匀后5000r/m离心5min，取上清，－20℃乙醇沉淀1～2h，10000r/m离心10min，1×TAE中电泳，紫外灯下观察结果。
1.8 细胞的苔盼蓝染色：参照文献［5］进行。
2 结果
2.1 SX-9和SR-1细胞存活份数测定结果：SX-9和SR-1细胞经不同剂量γ射线照射后的存活曲线见图1，照射后细胞存活份数有显著差异（P＜0.01）。表明SX-9细胞对γ射线敏感，是典型的放射敏感细胞。
图1 SX-9与SR-1细胞存活曲线
2.2 γ射线照射后SX-9细胞周期分布：为了便于研究γ射线照射前后细胞周期的变化，照射前用无血清的培养基培养36h使G1期细胞数达70%以上。照射后不同时间收集细胞，测定细胞周期分布，结果如图2所示：照射组和对照组加入含血清培养基后，细胞逐渐离开G1期，G1期细胞持续减少（SX-9细胞在照射后无G1期阻滞）；细胞沿着细胞周期进入S期和G2期，使G2期细胞持续增多，8、16Gy照射后24h其G2期细胞数显著增加至70%，其G2期阻滞明显，这说明对放射敏感的SX-9细胞无G1期阻滞，但存在G2期检查点（checkpoint）。
2.3 γ射线照射后SR-1的细胞周期分布: 细胞处理与SX-9细胞一致，结果如图3所示: 8 ，16Gy照射后4h达最高值。 可见照射后SR-1细胞不仅存在G2期阻滞，而且存在G1期阻滞。
2.4 RT-PCR克隆SX-9细胞 p53基因cDNA: 研究认为，细胞G1期阻滞与p53基因调控有关［6］。为明确SX-9细胞周期G1期阻滞的消失是否与p53基因状态有关，作者用RT-PCR方法扩增p53基因cDNA（图4），将其克隆进pUC-T载体，然后用NotI酶切鉴定（图5），鉴定正确后用全自动核酸测序仪测序（图6）。结果发现，p53基因的第5外显子有基因突变，即T404→C404，相应的氨基酸残基由Val135→Ala135。提示SX-9细胞G1期阻滞的消失可能是由于其p53基因突变导致功能异常所引起的。此突变p53的测序结果已登录到Genebank，登录号为AF161020。
图2 不同剂量γ射线照射SX-9细胞后细胞周期各时相变化曲线
a、b、c分别为不同剂量照射后G1、S、G2期细胞数随时间变化规律
图3 不同剂量γ射线照射SR-1细胞后细胞周期各时相变化曲线
2.5 γ射线照射后基因组DNA电泳以及细胞苔盼蓝染色： 流式细胞仪检测SX-9和SR-1细胞4，8、16Gy γ射线照射后0、2、4、8、14、24、36h的凋亡细胞百分数均小于10%。分别提取其基因组DNA，电泳后未发现有典型的DNA梯带图谱，这与流式细胞仪检测的结果是一致的，即SX-9和SR-1细胞γ射线照射后早期无典型的细胞凋亡。用苔盼蓝染色的方法计算两细胞不同剂量照后24h死亡细胞百分数，结果与对照组比较差异无显著意义（P＞0.05），这说明SX-9和SR-1细胞照射后无间期死亡。
3 讨论
SX-9细胞是由小鼠乳腺癌细胞SR-1经拟放射诱导物处理得到的放射敏感细胞，研究发现X射线照射后SX-9细胞DNA双链重接速率和重接水平明显降低［7，8］ 。因而认为其DNA损伤修复缺陷是其对放射敏感的主要原因。本研究发现，γ射线照射后SX-9和SR-1细胞存活份数差异有显著意义，与X射线类似，SX-9细胞对γ射线超敏感。SX-9细胞照射后细胞周期分布与亲本细胞SR-1不同：放射敏感细胞SX-9 G1期阻滞消失，但仍存在G2期阻滞，而SR-1细胞既存在G1期阻滞也存在G2期阻滞。RT-PCR克隆SX-9细胞的p53基因cDNA发现，其p53基因第五外显子有一处突变，此位点位于p53蛋白与特异DNA序列相互作用的位置［9］。照射后SX-9和SR-1细胞检测不到典型的DNA ladder，流式细胞仪的检测结果与之相似，用苔盼蓝染色鉴定两细胞的死亡细胞比例也无显著差别。这表明SX-9细胞放射敏感性增高不是通过细胞凋亡和间期死亡，而是通过照射后G2期阻滞引发的。通常认为，各种内外原因导致DNA损伤使细胞发生细胞周期阻滞时，细胞将启动其DNA损伤修复机制，在损伤DNA得到修复后，细胞重新进入细胞周期。由于SX-9细胞 DNA损伤修复缺陷，G2期阻滞时无法完成DNA损伤修复，从而导致其G2期阻滞大大延长，细胞增殖能力下降，引起细胞增殖死亡。
Cistuli 等［10］曾报道过一株类似的小鼠放射敏感细胞株D9间皮细胞，该细胞在与SX-9细胞p53基因相同的位置发生相同的Ala135自发突变，G1期阻滞消失，但存在G2期阻滞。G1阻滞的消失导致D9细胞照射后微核增加，基因组不稳定性高，使放射敏感性增加。此外，与SX-9类似的细胞还有M059J（PK-）细胞、SW480细胞、Ku86缺陷CHO细胞、HDF-1缺陷酵母等，在各种处理后都阻滞于G2期［11-14］。由于它们的DNA-PK基因功能都有缺陷，且对放射敏感，因而提示细胞放射敏感性、细胞周期与DNA-PK具有内在联系［15］。
图4 RT-PCR 克隆P53基因cDNA1,2,3,4:RT-PCR产物M:λDNA/EooRI+HindIII分子量标准
5 PUC-Tp53重组质粒的酶切鉴pg 1:pUC-Tp53重组质粒 2:pUC-Tp53重组质粒Not I酶切；MλDNA/EooRI+HindIII分子量标准
图6 P53基因突变区域的核酸自动测序结果
基金项目：国家自然科学基金资助项目（39900031）
参 考 文 献
1，Coucke PA，Crompton NEB. MolecuLar basis of radioresistance. Euro J Cancer ，1995，31A：844-846.
2，Rhys CM，Bohr VA. Mammalian DNA repair responses and genomic instability. EXS，1996，77:289-305.
3，Ghosh S，Schroeter D，Paweletz N. Okadaic acid overrides the S-phase checkpoint and accelerates progression of G2-phase to induce premature mitosis in Hela cells. Exp Cell Res，1996，227：165-169.
4，Bienz B，Homi R，Givol D， et al. Analysis of the gene coding of the murine cellular tumor antigen p53. EMBO J，1984，3：2179-2183.
5，杨景山，主编.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990.118-119.
6，Maity A，McKenna WG，Muschel RS，et al. The moleclar basis for cell cycle follows ionizing radiation. Radiother Oncol，1994，31：1-13.
7，Sato K，Ito A，Shiomi T，et al. X-ray-sensitive mutants of mouse mammary carcinoma cells are hypersensitive to bleomycin and hydrogenperoxide. Jpn J Cancer Res， 1986，77：456-461.
8，周平坤，魏康.小鼠乳癌细胞放射敏感突变株SX-9 DNA双链断裂及重接修复研究. 放射研究与放射工艺学报，1992，10：44-47.
9，Montenarh M. Boichemical properties of the growth suppressor /oncoprotein p53. Oncogene，1992，7：1673-1680.
10，Cistuli CA，Sorger T，Marsella JM，et al. Spontaneous p53 mutation in murine mesothelial cells increased sensitivity to DNA damage induced by asbestos and ionzing radiation. Toxicol Appl Pharmaol，1996，141：264-271.
11，Allalunis-Turner J， Barron GM，Day RS，Intact G2-phase checkpoint in cells of a human cell line lacking DNA-dependent protein kinase activity. Radiat Res,1997 ，147: 284-287.
12，Rosenzweig KE，Youmell MB，Palayoor ST，et al. Radiosensitization of human tumor cells by the phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors wortmannin and LY294002 correlates with inhibition of DNA-dependent protein kinase and prolonged G2-M delay. Clin Cancer Res,1997 ， 3: 1149-1156.
13，Munoz P，Zdzienicka MZ，Blanchard JM，et al. Hypersensitivity of Ku-deficient cells toward the DNA topoisomerase II inhibitor ICRF-193 suggests a novel role for Ku antigen during the G2 and M phases of the cell cycle. Mol Cell Biol，1998 ，18: 5797-5808 .
14，Feldmann H，Winnacker ELA， Putative homologue of the human autoantigen Ku from Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem，1993 ，268 :12895-12900.
15，Fukumura R，Araki R， Fujimori A，et al. Murine cell line SX-9 bearing a mutation in the dna-pkcs gene exhibits aberrant V(D)J recombination not only in the coding joint but also in the signal joint.J Biol Chem，1998, 273: 13058-13064.
(收稿日期：1999-07-08)
用户登录 
新用户注册