急性白血病化疗后“凋亡彗星”的检测及临床意义

临床血液学杂志 2000年第5期第13卷 临床研究

作者：黄成垠　薛重重　郑晓丽　吴雅锋　邢宪英　李增杰　陈立新

单位：黄成垠（沧州市中心医院血液科　河北沧州，061001）；薛重重（沧州市中心医院血液科　河北沧州，061001）；郑晓丽（沧州市中西医结合医院检验科）；吴雅锋（沧州市中心医院血液科　河北沧州，061001）；邢宪英（沧州市中心医院血液科　河北沧州，061001）；李增杰（沧州市中心医院血液科　河北沧州，061001）；陈立新（沧州市中西医结合医院检验科）

关键词：白血病；急性；碱性单细胞凝胶电泳；细胞凋亡；化疗

　　摘要　目的：观察急性白血病化疗后“凋亡彗星”的变化及 其与临床疗效的关系。方法：采用改良Singh法(改良碱性单细胞凝胶电泳，即“彗星试验”)检 测15例急性白血病患者化疗后4、8、12、24、36和72 h“凋亡彗星”的变化。结果：化疗前“凋亡彗星”均＜0.5%,化疗8 h开始增高,24 h达高峰 ，“凋亡彗星”百分率＞98.0%、骨髓白血病细胞减少指数(MBDI)＞65.0%的11例经 1个疗程化疗完全缓解；“凋亡彗星”百分率为95.5%、MBDI为18.5%的1例经2个疗 程化疗完全缓解;“凋亡彗星”百分率为84.0%、MBDI为6.1%的1例经2个疗程化疗部 分缓解；“凋亡彗星”百分率为3.0%和5.5%、MBDI为1.1%和1.6%的2例患 者临床未缓解。结论：应用“彗星试验”在急性白血病患者化疗过程中可检出大量早期凋 亡细胞；“凋亡彗星”的检测是早期判断化疗疗效的良好指标。

Determination of apoptotic comet in acute leukemia undergoing

　　c hemotherapy and its clinical implication

HUANG Cheng-yin　Xue Chong-chong　WU Ya-feng　XING Xian-ying　LI Zeng-jie

　　（Department of Hematology,Cangzhou Central Hospital,Cangzho u,Hebei,061001）

　　Zheng Xiao-li　Che Li-xin

　　（Department of Clinical Laboratory Cangzhou Hospital of Integrated T raditional and Westem Medicine）

　　Abstract　Objective:To investigate the variation of ap optotic comet in acute leukemia (AL) undergoing chemotherapy and the ralationshi p between apoptotic rate and treatment outcomes.Methods:Using improved singh′s method,the apoptotic comet rate was measured in 15 patients with AL after chemotherapy.Result:Before chemotherapy,the apoptotic comet rate were＜ 0.5% in all cases. It started to increase at 8 hours and was up to peak at 2 4 hours after chemotherapy. In 15 patients,11 cases achieved CR after one course and all of their apoptotic comet rate＞98.0%,MBDI＞65.0%;Apoptotic come t rate 95.5%、MBDI 18.5% was observed in one case that showed CR after t wo courses;One case achieved PR after two courses and his apoptotic comet rate w as 84.0%，MBDI was 6.1%;Two cases were unremission that showed apoptotic comet rate 3.0%、5.5%, MBDI 1.1%、1.6% respectively.Conclusion:Using comet assay,a large number of early stage apoptotic cells were detected easily in vivo in patients with AL during inducti on chemotherapy;Comet assay is a good method in predicting efficacy of chemother apy.

　　Key words　Leukemia，acute　Comet assay　Cell apoptosis　C hemotherapy

　　碱性单细胞凝胶电泳又称“彗星试验(Comet assay)”，是近 年来发展起来的一种简便、快速、敏感性很高的检测单细胞DNA 断裂损伤的方法^〔1〕 。将少量细胞悬浮于载玻片上的一薄层凝胶内，裂解后在碱性条件下电泳，损伤的DNA从 核中溢出，经溴乙锭染色后，在荧光显微镜下可见彗星状图案，移出核外的受损DNA形成彗 星尾部，未损伤的DNA仍在核中保持球形，构成彗星头部；细胞凋亡时，DNA 在质膜损伤前 断裂，这种断裂很容易被这种方法显示，称为“凋亡彗星”。“凋亡彗星”的数量代表凋亡 细胞的数量^〔2〕。体外实验证明，几乎所有的化疗药物都可以诱导细胞凋亡，快速 而敏感的检测早期细胞凋亡的“彗星试验”是评价化疗药物敏感性和早期判断白血病化疗疗 效的较好指标。

　　1　资料与方法

　　1.1　研究对象

　　本组15例急性白血病患者均为我院确诊的初治病例，男13例，女2例，年龄23～61岁。急性 非淋巴细胞白血病(ANLL)12例，其中M₁ 3例，M₂ 5例，M₄ 1例，M₅ 2例，M₇ 1例 ；急性淋巴细胞白血病(ALL)3例。ANLL患者给予标准DA或HA方案化疗，ALL患者给予VDCP方 案化疗。分别于化疗前及化疗后采集患者外周静脉血或骨髓液，用淋巴细胞分离液分离收集 单个核细胞，并将细胞浓度调为5.0×10⁹/L，同时涂片作苔盼蓝染色，细胞存活率应 ＞95%。化疗前体内“凋亡彗星“均＜0.5%。

　　1.2　检测方法

　　采用转移电泳仪和水平电泳槽(南京大学生物技术开发公司产品)、正常融点和低融点琼脂糖 、L-12-烷基肌氨酸钠(华美公司产品)、二甲基亚砜(Sigma公司产品)、Tritonx-100(FAR CO公司产品)，其他试剂均为国产。

　　取磨砂载玻片，在其毛面铺1.0%正常融点琼脂糖1 ml,室温凝固后刮去;接着铺第一层 0.5％正常融点琼脂糖80 μl,立即加盖玻片(24.00 mm×50.00 mm×0.17 mm )一张,在4℃温度中凝固5 min；小心取下盖玻片,再铺第二层含待测细胞的低融点琼脂糖75 μl(10 μl细胞悬液与65 μl 0.7％低融点琼脂糖在37℃温度下混合),加盖玻片,在4℃ 温度下 凝固10 min；取下盖玻片, 在第二层胶上再铺0.7％低融点琼脂糖75 μl,加盖玻片，在 4℃温度下凝固10 min(所有琼脂糖均用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS配制,操作过程中应 尽量避免产生气泡)。去除盖玻片，浸于新鲜配制的冷裂解液(NaCl 14.61 g、Na₂-E DTA3.72 g、Tris 0.12 g、肌氨酸钠1.00 g、NaOH 1.30 g，加蒸馏水定 容至89 ml，临用前加Tritonx-100 1 ml，二甲基亚砜10 ml，置4℃温度中备用)中至少1 h 。取出玻片控干，置于水平电泳槽中，玻片间不留空隙，槽内加电泳液(NaOH 42 g、Na₂ -EDTA1.302 g，加蒸馏水3 500 ml) 至液面高出玻片0.2 cm,静置20 min,然后在2 5 V电压条件下通过升降电泳液面将电流调至300 mA,电泳20 min。取出玻片,用中性化液(pH 7.5、0.4 mol/L Tris-HCl缓冲液)轻轻滴洗玻片凝胶5次，每次1 min。控干玻片 ，每张加100 μl溴乙锭(2×10³ μg/L)染色液，加盖玻片在4℃温度下染色30 min，在落 射式荧光显微镜下观察，计数200个细胞，计算“凋亡彗星”百分率。

　　1.3　疗效判定

　　治疗效果按1987年苏州全国白血病化疗讨论会制定的疗效标准进行评定。

　　2　结果

　　2.1　化疗后体内“凋亡彗星”的动态变化

　　对外周血白血病细胞＞60％的8例患者在化疗后4、8、12、24、36和72 h抽取静脉血进行“ 凋亡彗星”检测。化疗8 h后“凋亡彗星”开始增高，24 h达高峰，此后其凋亡率维持不变 或略有下降。如果体内白血病细胞均对化疗敏感，那么化疗24 h，“凋亡彗星”百分率可达 100%，随着化疗的进行，其比率基本维持不变；如果体内存在不敏感细胞，“凋亡彗星”在 化疗24 h达高峰，此后随化疗时间的延长，其比率下降。对外周血无白血病细胞或比例较低 的3 例白血病患者在化疗后12、24和48 h行骨髓“凋亡彗星”检测，显示“凋亡彗星”在化 疗后24 h的产率达最大。

　　2.2　“凋亡彗星”检测结果与临床疗效的关系

　　15例患者中，11例经1个疗程化疗完全缓解，1例经2个疗程化疗完全缓解，1例部分缓解，2 例未缓解，化疗24 h的细胞凋亡率与临床疗效明显相关。11例经1个疗程化疗完全缓解的病 例，其化疗24 h的“凋亡彗星”百分率均在98.0%以上，化疗4 d后，骨髓白血病细胞减 少指数(MBDI)均＞65.0%；“凋亡彗星”百分率为95.5％、MBDI为18.5％的1例 患者在2个疗程化疗达完全缓解;“凋亡彗星”百分率为84.0％、MBDI为6.1％的1例 患者经2个疗程化疗达部分缓解；MBDI分别为1.1％和1.6％、“凋亡彗星”百分率 分别为3.0％和5.5％的2例患者临床未获缓解，属于化疗无效(见表1)。

表1　15例急性白血病“凋亡彗星”检测结果与临床疗效

　　注：MBDI为骨髓白血病细胞减少指数；CR为完全缓解，PR为部分缓解，NR为未缓解

3　讨论

　　Rydberg于1978 年首先建立了单细胞凝胶电泳技术并成功地应用于DNA损伤的检测 ，由于该方法的敏感性差而未受重视。1984年Ostling等将细胞包埋在琼脂中，在高浓度盐 和洗涤剂条件下溶解后，在中性条件下电泳，使测试的敏感性大大提高，但只能检测DNA 双 链断裂损伤。Singh等^〔1〕于1988年将电泳条件改为高pH碱性,建立了碱性单细胞凝 胶电泳技术，使此技术更适于DNA单链断裂的检测,并使其检测灵敏度达0.1 DNA断裂/10 ⁹dolton。后来，此方法被广泛采用，并不断改良。本文所用方法就是综合这些改良方法 ^〔3〕经适当改进，可更适于临床应用。

　　“彗星试验”广泛应用于DNA放射损伤、剪切损伤和DNA交联的检测等。1993年Olive等 〔2〕首先将其应用于细胞凋亡的检测。细胞凋亡时，DNA断裂一旦启动即很快结束，几 乎不存在中等程度的DNA损伤，故“凋亡彗星”代表早期的细胞凋亡,能将凋亡与坏死分开， 是一种简便、快速而敏感的早期检测方法。

　　药理学研究表明,几乎所有的化疗药物均能诱导细胞凋亡,能否将诱导细胞凋亡作为化疗药物 敏感性的指标，能否通过对患者化疗早期白血病细胞凋亡的检测以判断化疗疗效，成为目前 研究的热点。任新萍等^〔4〕应用细胞形态学、DNA凝胶电泳、流式细胞仪研究了20例 不同类型的急性白血病化疗过程中细胞凋亡的动态变化，结果外周血白细胞、幼稚细胞在化 疗过程中明显下降，但无凋亡细胞和DNA Ladder形成，DNA含量分析也无亚二倍体峰出现。 作者认为，化疗药物诱导细胞凋亡后，在血循环中很快清除，形态学、DNA电泳、DNA含量分 析的方法检测早期凋亡细胞不够敏感，故检测凋亡细胞困难。本研究表明，在急性白血病化 疗过程中，用“彗星试验”方法可在体内检测出大量的早期凋亡细胞，并且这种早期的细胞 凋亡持续存在，化疗药物诱导早期细胞凋亡后，很快被血循环中的网状内皮系统清除，故很 难检测到中、晚期细胞凋亡，化疗早期“凋亡彗星”的检测是判断化疗疗效的很好指标。

　　选择敏感药物是提高疗效、减轻正常组织损伤的有效方法。对药物疗效的预测，临床常 用的是MBDI，但MBDI低并不一定说明化疗药物没有疗效，MBDI为1%～20%的患者仍有22%的缓 解率，说明MBDI对判断疗效有一定的局限性。“彗星试验”能早期直接反映白血病细胞对化 疗药物的敏感性，对化疗疗效的判断明显优于MBDI。

(编辑 王铨)

　　参考文献

　　1，Singh N P, Mccoy M T,Tice R R,et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.Exp Cell Res,1988, 175:184～191

　　2，Olive P L,Frazer G, Banath J P,et al. Radiation induced apoptosis measured i n TK₆ human B lymphoblast cell using the comet assay. Radiat Res,1993,136:130 ～136

　　3，Mckelvey-Martin V J, Green M H L, Schmezer P,et al. The single cell gel el ectrophoresis assay (comet assay):A european review.Mutat Res,1993,288:47～63

　　4，任新萍，高晖，王申五，等.急性白血病化疗和体内细胞凋亡关系的研究.中华肿瘤杂志 ，1998,20:191～192

(收稿 1999-10-25　修回 2000-05-16)