乳腺癌患者自体造血干细胞的体外净化

中华血液学杂志 1998年第8期第19卷 综述

作者：韩晓红　石远凯

单位：100021　北京,中国医学科学院、中国协和医科大学肿瘤医院

　　自体造血干细胞移植(AHSCT)已成为现代乳腺癌强烈化疗的重要支持手段。用免疫细胞化学方法检测发现，62.3％的骨髓和9.8％的外周血内可检测出肿瘤细胞^［1］。但Brugger等^［2］证明实体瘤患者进行外周血干细胞(PBSC)动员过程中，肿瘤细胞也会被动员进入外周血，其中Ⅳ期乳腺癌患者动员后PBSC中全部检出肿瘤细胞，动员前未检出肿瘤细胞的患者，经强烈化疗结合粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员后，有21％的患者PBSC中检出肿瘤细胞。因此，如何有效地进行体外净化自体造血干细胞（AHSC）已成为关注的热点。

　　肿瘤患者AHSC的净化是利用肿瘤细胞与正常造血干细胞的生物学差异，选择性地最大限度杀伤肿瘤细胞，而尽可能地保留正常造血细胞，以尽量避免移植物中肿瘤细胞的再次植入。主要方法可分为阴性选择净化和阳性选择净化。

　　1　阴性选择净化

　　1.1　药物净化：4-氢过氧环磷酰胺（4-HC）进入细胞后水解为4-羟环磷酰胺而发挥抗肿瘤作用。早期造血干细胞对它相对不敏感^［3］。将4-HC与乳腺癌细胞进行体外混合培养，可获得2.5个对数级的杀伤效果，肿瘤细胞的克隆形成能力明显下降^［4］。同时还可使自然杀伤（NK）细胞数量增加，起到杀伤肿瘤细胞的作用。但4-HC对粒／单系祖细胞集落形成单位（CFU-GM）亦有杀伤作用。将乳腺癌细胞与细胞毒类药物Ether Lipid 75μg/ml共同孵育4小时，然后冷冻保存，净化效果可达1个对数级，回输经此法净化的PBSC，造血功能恢复时间与未净化组没有显著性差异^［5］。另有应用多种药物进行协同净化，如4-HC联合长春新碱、足叶乙甙或甲基泼尼龙等，都有较好的净化效果^［6］。

　　1.2　物理净化：有些肿瘤细胞对温度的敏感程度比正常造血干细胞高，因此可通过高温达到净化目的，但乳腺癌细胞却与之相反。乳腺癌细胞（CAMA-1）经45℃2小时和44℃4小时处理后，取得3个对数级的杀伤效果，但正常骨髓细胞经43℃2小时和44℃1小时处理后，CFU-GM回收率仅为1％^［7］。因此正常骨髓细胞比乳腺癌细胞对高温更敏感，损伤程度更高。Schriber等^［8］利用密度梯度分离法净化乳腺癌患者的PBSC，获得了较好的净化效果。

　　1.3　免疫学净化:使用对癌细胞具有特异性的单克隆抗体（单抗）处理PBSC悬液，使抗体选择性地与肿瘤细胞结合，然后通过适当方法加以清除。免疫学净化法的优点是高效和特异。但肿瘤细胞表面抗原常呈异质性和表达较弱，从而影响净化效果。

　　补体依赖的细胞毒法为将乳腺癌细胞与特异性单抗共同孵育，再加入补体，从而达到净化目的，但此法对乳腺癌的净化效果不甚理想。还可将结合有细菌外毒素的肿瘤特异性抗体与肿瘤细胞结合,特异性地杀伤肿瘤细胞而对正常造血干细胞无毒性作用^［9］。另外，用肿瘤特异性单抗包被微球体或金属胶粒，增加肿瘤细胞密度或赋予其磁性，进而通过物理方法去除癌细胞，可获得良好的净化效果，且对正常造血干细胞无毒副作用。例如,将抗乳腺癌的单抗与混有一定比例乳腺癌细胞的骨髓或PBSC共同孵育，然后加入包被有羊抗鼠免疫球蛋白的免疫磁珠，从而使乳腺癌细胞得以分离，净化效果可达3～4个对数级^［10］。

　　2　阳性选择净化

　　CD₃₄抗原选择性地表达于造血干、祖细胞膜上。用免疫阳性选择技术将CD₃₄⁺细胞纯化，去除所有成熟细胞以及CD₃₄^-的肿瘤细胞。

　　2.1　流式细胞仪分选法（FACS）∶FACS具有快速、准确和分选纯度高等特点^［11］，但临床移植需要的有核细胞数常大于10¹⁰，目前FACS还难于分选到能满足临床需要的细胞数量。

　　2.2　生物素-抗亲合素柱分离法∶使用CEPRATE SC Stem Cell Concentrator系统净化乳腺癌患者的造血干细胞，干细胞与抗CD₃₄单抗（12.8）及生物素共同孵育，然后使其通过包被有多聚丙烯酰胺珠的亲合素柱净化出CD₃₄⁺ 细胞^［1］。此法CD₃₄^＋细胞回收率40％～50％，CD₃₄⁺细胞净化效果可达4个对数级，CFU-GM较净化前增加40～50倍。回输经上述方法净化后的CD₃₄^＋ 骨髓细胞或PBSC，临床未出现急性不良反应，造血功能也得到迅速恢复。此方法的缺点是非特异性结合多、细胞分散、结合不充分及解离困难等。

　　2.3　Panning法∶使用CELLector Flasks系统^［12］，净化效果达3个对数级。但此法净化纯度不很稳定，有可能将CD₃₄抗原性削弱，有10％～20％的CD₃₄⁺细胞丢失。

　　2.4　免疫磁珠分离法∶Williams等^［13］对9例乳腺癌患者的PBSC在IsoLex免疫磁珠分离系统上分离CD₃₄⁺细胞。将单个核细胞与抗CD₃₄单抗（9C5）结合，靶细胞与结合有抗鼠单抗的磁珠形成玫瑰花结，然后将此混合物通过磁场，保留结合有CD₃₄⁺的珠子，用木瓜蛋白酶处理，使抗体与细胞分离，得到纯化的CD₃₄⁺细胞。将净化后的CD₃₄⁺细胞回输给患者，临床未出现不良反应，造血功能得到迅速恢复。但木瓜蛋白酶会不同程度地消化其它细胞表面蛋白。

　　3　生物学方法

　　在移植物中同时加入白细胞介素-2（IL-2)、干扰素和肿瘤坏死因子，其净化效果更好。Areman等^［14］对65例进行AHSCT的乳腺癌患者，在AHSC解冻后回输前与IL-2共同培养24小时，激活PBSC，使其产生移植物抗肿瘤效应（GVT）。单个核细胞回收率82％，CD₃₄⁺ 细胞回收率70％，CFU-GM形成能力及造血功能恢复时间与未加IL-2组相比均无明显变化，取得了较好的临床效果。近来有人应用蛋白-酪氨酸激酶抑制物使特异性的反义寡核苷酸与细胞内靶基因结合或与蛋白作用，抑制或终止癌基因表达，使肿瘤细胞分化或凋亡^［15］ 。利用人类腺病毒基因转染技术净化乳腺癌细胞也被证明是一种有效的净化手段^［16］。经阳性选择净化后的CD₃₄⁺细胞中仍然有可能存在乳腺癌细胞，若再用阴性选择净化去除CD₃₃^-细胞或HLA-DR^-细胞，或联合其它净化方法，可彻底清除移植物中残存的肿瘤细胞。Anderson等^［3］应用免疫磁珠与4-HC联合净化乳腺癌细胞，净化效果达到5个对数级，可得到高纯度的CD₃₄⁺细胞并增加回收率。

参 考 文 献

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　　2　Brugger W,Bross KJ,Glatt M,et al.Mobilization of tumor cells and hematopoietic progenitor cells into peripheral blood of patients with solid tumors.Blood,1994,83:636-640.

　　3　Anderson IC,Shall EJ,Jeslie DS,et al.Elimination of malignant clonogenic breast cancer cells from human bone marrow.Cancer Res,1989,49:4659-4664.

　　4　Passos-Coelho J,Ross AA,Davis JM,et al.Bone marrow micrometastases in chemotherapy-responsive advanced breast cancer:effect of ex vivo purging with 4-hydroperoxycyclophosphamide.Cancer Res,1994,54:2366-2371.

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(收稿:1998-02-12　　修回:1998-05-20)

(校对:王叶青)