高强度聚焦超声及其联合顺铂对人膀胱癌细胞的体外抑制效应

中国超声医学杂志 2000年第5期第16卷 基础研究

作者：吴刚　杨光永　乔天愚　伍烽　王智彪

单位：吴刚　伍烽　王智彪（400016　重庆医科大学医学超声工程研究所吴刚现在重庆第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科）；杨光永　乔天愚（重庆医科大学第二医院泌尿外科）

　　关键词： 超声；膀胱癌；药物疗法；顺铂

　　摘要　目的：研究高强度聚焦超声(HIFU)及其联合顺铂(PDD)对人膀胱癌细胞株T24的体外效应。方法：不同剂量HIFU单独及联合PDD作用于T24细胞悬液后观察细胞存活率及生长增殖的变化。结果：一定剂量的HIFU可使T24细胞存活率直线下降并产生短暂的生长抑制作用; 低剂量HIFU(11.5W/cm²×6′)可使PDD对T24细胞抑制率增加; HIFU(450W/cm²×6′)与PDD联合作用可使T24细胞生长增殖在十天内基本停滞。结论：在体外以空化、机械效应为主的HIFU对T24细胞具有急性致死及短暂的生长抑制作用; 对PDD具有增敏作用; 联合PDD作用具有协同效应。

Inhibition Effects of High Intensity Focused Ultrasound inCombination with Cisplatin on Human Bladder Cancer Cell In Vitro

Wu Gang　Yang Guangyong　Qiao Tianyu　et al

　　（Institute of Ultrasound Engineering in Medicine, Chongqing Medical University,Chongqing　400016）

　　ABSTRACT　Objective:To study the effects of high intensity focused ultrasound(HIFU) in combination with Cisplatin (Platinum dichloro-diamine PDD) on human bladder cancer cell.Methods：After action by different intensities HIFU combined with PDD, to observe the changes of T24 cell survival rate and growth curves.Results:A certain intensity HIFU decreases the cell survival rate and inhibits cell growth of the tumor. The HIFU irradiation (11.5W/cm²×6s) can enhance PDD inhibition to T24 cell. HIFU(450W/cm²×6s) combined with PDD can halt T24 cell growth in 10d.Conclusion:In vitro effects of HIFU was cavitation and killing T24 cell, inhibiting cell growth and potentiating sensitivity of PDD. HIFU combined with PDD has synergitic inhibition effect to T24 cancer cell line.

　　KEY WORDS　Ultrasound　Bladder neoplasms　Drug therapy　Cisplatin

　　高强度聚焦超声(High Intensity Focused Ultrasound, HIFU)是近年来兴起的非侵入性治疗技术, 其将高功率超声波聚焦于深部病变组织, 通过产生瞬态高温、空化及机械效应对靶组织造成不可逆的损伤而达到“深部切除”的治疗目的。目前该技术主要用于肿瘤的治疗, 研究成果及应用前景令人鼓舞。瞬态高温效应是HIFU破坏肿瘤组织的主要机制, 但空化、机械效应范围远大于高热效应范围, 其对高温区边缘肿瘤细胞的作用更为重要。我们选用人膀胱癌细胞株T24制成悬液, 用体外实验方法摒除热效应作用, 主要观察HIFU的空化、机械效应及其联合顺铂(PDD)　　对T24细胞的存活率及生长增殖的影响并探讨可能的机制, 为进一步HIFU治疗肿瘤的研究提供理论与实验依据。

　　资料与方法

　　1、HIFU治疗系统样机:由重庆海扶技术有限公司研制。最大输出功率3000W, 连续可调。探头系透镜聚焦原理制作而成, 工作频率1.6MHz, 直径12.0cm, 聚焦深度10.3cm, 物理学焦域1.1mm×1.1mm×3.3mm。声强、声场测试用水柱法测定辐射压力, 由Beissner全吸收靶所受辐射压力公式直接计算出焦域内各点声强; 用空化气泡光折射观察声场。

　　2、T24细胞悬液制作及HIFU的照射过程:实验时采用常规培养处于指数增长期的T24细胞, 消化、充分吹打后制成浓度为1×10⁵/ml的细胞悬液分装于无菌聚乙烯试管(每管1.2ml), 加盖后置于三维移动支架上, 37℃真空脱气水于试管外浸至悬液液平并且充盈于试管下端至HIFU探头之间, 调整HIFU焦域使之定位于细胞悬液中央, 启动治疗系统。所有实验照射时间均统一为6秒。

　　3、细胞存活率的测定:细胞悬液经不同声强的HIFU作用后接种于96孔培养板(n=8), 用MTT法测定光密度值, 根据公式计算出各组细胞存活率。

　　4、细胞生长曲线的绘制

　　不同声强的HIFU对细胞生长曲线的影响:细胞悬液经不同声强HIFU作用后用台盼兰染色法进行活细胞计数, 然后每组取相同数量活细胞接种于50ml培养瓶, 每瓶含细胞数3.0×10⁵/个, 每组18瓶。培养8h后各组取3瓶作活细胞计数并取其均值, 之后每天同样方法计数, 绘制生长曲线。

　　联合作用对细胞生长曲线的影响:实验分为4组。A组:正常对照; B组:单用HIFU; C组:单用顺铂; D组:HIFU+PDD。其中HIFU剂量为450W/cm²×6秒, PDD终浓度为3μg/ml, 药物作用48小时。

　　(1)、第一阶段生长曲线

　　细胞悬液经HIFU作用或零作用后接种于50ml培养瓶, 每组30瓶。按不同组分别加入PDD溶液或等量生理盐水, 48小时后弃去所有培养瓶的培养液, PBS液洗三次以终止PDD作用。每天每组取3瓶细胞行台盼兰染色法计数并取均值, 绘制第一阶段生长曲线(前5天)。

　　(2)、第二阶段生长曲线

　　第5天将各组所剩的培养细胞消化后行活细胞计数, 每组取相同数量(2×10⁵)活细胞重新接种于50ml培养瓶, 每组15瓶, 按同样方法每天行活细胞计数, 共5天, 完成第二阶段生长曲线。

　　5、MTT法测定PDD对细胞的抑制率:细胞悬液经0W/cm²(对照)、11.5W/cm²的HIFU进行照射, 然后按文献^〔1〕的记录的方法测定PDD的抑制率。

　　结　　果

　　HIFU声强(X)与T24细胞存活率(Y)的关系见图1。HIFU对细胞生长曲线的影响见图2。HIFU对顺铂的增敏作用见表1。联合作用对细胞生长曲线的影响见图3。

表1　顺铂联合HIFU对细胞的抑制率比较(%)

图 1　HIFU声强与细胞存活率的关系曲线

图 2　不同声强的HIFU对细胞生长的影响

　　由两个阶段生长曲线可以看出:单用HIFU组对细胞生长抑制作用是短暂的; 单用PDD组在第一阶段增殖陷于停滞, 但第二阶段开始缓慢增殖。联合作用组活细胞数在第一阶段撤除PDD作用后仍呈进行性下降, 第二阶段增殖基本处于停滞。

　　讨　　论

　　HIFU是通过聚能方式对肿瘤组织产生定点损伤, 其中心区域温度最高, 周围呈放射递减。Vallancien等^〔2〕证实HIFU能对前列腺标本组织内0.3～1cm范围升温至80℃以上而邻近4mm范围内则迅速降至45℃以下。目前国际上主要通过三维移动探头, 点阵排列高热损伤点来达到破坏肿瘤组织。但由于高热聚焦区域较小、目前定位技术的困难及“损伤-损伤干扰”^〔3〕, 常在高温区边缘会有残活细胞的存在。程树群等^〔4〕发现HIFU单次照射肝肿瘤后靶区尚有存活的细胞小岛。因空化、机械效应范围远大于热效应范围, 研究这部分受到空化、机械效应而未受到高热效应的残存肿瘤细胞发生的生物学改变及对抗癌药的敏感性, 对指导HIFU完整破坏肿瘤及配合化学治疗有重要意义。

图 3　第一阶段生长曲线

图 4　第二阶段生长曲线

　　在我们前期实验中已经证实:声强小于1000W/cm²的HIFU作用时间小于10秒不会对细胞悬液产生升温效应, 其效应机制应以空化、机械效应为主。通过对HIFU作用后T24细胞的存活率及生长曲线观察:HIFU的空化、机械效应同样可对肿瘤细胞产生急性致死作用; 450W/cm²及823.7W/cm²两组生长曲线中8小时活细胞数反而下降, 提示部分肿瘤细胞发生了渐进性坏死, HIFU可对肿瘤细胞产生亚急性致死作用。HIFU剂量越大, 其急性、亚急性致死作用就越强。然而HIFU对T24细胞生长增殖的抑制作用却只表现为较短时间, 实验中11.5W/cm²剂量对T24细胞生长基本无影响, 450W/cm²、823.7W/cm²表现为5天内有一定生长抑制作用, 而后细胞生长增殖速度基本与对照组一致。提示HIFU治疗肿瘤若不能完全杀死肿瘤细胞, 应该重复治疗或辅以其他治疗以防止肿瘤复发。

　　关于HIFU辅以化疗治疗肿瘤尚缺乏较系统的研究。Yang等^〔5〕提出:HIFU对肿瘤细胞及组织破坏后是否会影响抗癌药作用?HIFU是否会造成抗癌药分解及活性丧失?高能冲击波(HESW)与HIFU相似, 均为聚焦的机械波。Berens等^〔6〕及Lee等^〔5〕曾报道HESW联合PDD对体外肿瘤细胞具有协同抑制作用。国内于廷和等证实HIFU可造成肿瘤细胞膜通透性增加而使细胞内阿霉素(ADM)聚积量增高从而增强ADM的细胞毒作用。本实验证实HIFU对PDD具有增敏作用, 联合作用具有协同效应, 这对HIFU治疗可积极辅以化疗是一个支持。提示HIFU治疗膀胱癌若有残存“细胞小岛”存在, 局部灌注或全身化疗应该有积极意义。PDD是膀胱癌局部灌注及全身化疗的常用药物, 其无需载体转运即可进入细胞内产生作用, 细胞内PDD聚积量主要取决于细胞膜的通透性及细胞内外药物浓度差。HIFU造成细胞生物膜结构和功能改变使膜通透性增高, 细胞内PDD聚积量增多而增强PDD的细胞毒作用应该是协同效应产生的主要原因。另外, PDD联合HIFU治疗肿瘤还有着更远大的意义。PDD完全具备作为提高组织声阻抗的理想媒质的三个条件^〔8〕:(1)媒质本身是或含有重金属或重离子; (2)具有导向性质和定位性质, 即可直接注射或经血管途径注射, 能滞留在肿瘤部位; (3)媒质对机体损害小且无排异。联合治疗时若先行PDD瘤内注射而后行HIFU治疗, 由于瘤组织声阻抗的提高, 则可增强瘤体的显像定位及协同HIFU的升温效应, 加之药物本身及协同HIFU的抗癌作用, 治疗肿瘤就会起到事半功倍的效果, 这是将来HIFU治疗肿瘤的一个可能的新途径, 值得进一步研究及探讨。

　　本项目受“九五”国家重点科技攻关项目基金(基金号:96－905－02－-01)资助

　　参考文献

　　1，张丽萍, 许良中.体外癌株嗜银蛋白染色法与MTT法化疗敏感性的对比研究.实用肿瘤杂志, 1997,12:81～83

　　2，Vallancien G, Kastler EC, Chopin D, et al. Focused extracorporeal pyrotherapy: Experimental results. Eur Urol, 1991,20:211～219

　　3，Chen L, Rivens I, ter Haar GR, et al. Histological changes in rat liver tumours treated with high intensity focused ultrasound. Ultrasound Med Biol, 1993,19:67～74

　　4，程树群, 周信达, 汤钊猷, 等.高功率聚焦超声高温破坏肝肿瘤的病理学改变.中华实验外科杂志, 1996，13(3)：135～136

　　5，Yang R, Reilly CR, Rescorla FJ, et al. High-intensity focused ultrasound in the treatment of experimental livetr cancer. Arch Surg, 1991, 126:1002～1009

　　6，Berens ME, Welander CE, Griffin AS, et al. Effect of acoustic shock waves on colonogenic growth and drug sensitivity of human tumor cells in vitro. J Urol, 1989, 142:1090～1094

　　7，Lee K, O′Donnell RW, Smith P, et al. High energy shock waves (HESW) enhance antitumor activity of cisplatin (DDP) in murine bladder cancer, MBT-2. J Urol 1988, 139:326A

　　8，程树群, 周信达, 汤钊猷, 等.碘化油与高功率聚焦超声破坏肝组织的协同升温效应研究.中国超声医学杂志, 1997, 13(4):1～4

1999-11-05收稿