全反式维甲酸诱导人膀胱癌细胞T₂₄凋亡的研究

中华实验外科杂志 1999年第6期第16卷 论　著

作者：杨嗣星　张雪军　王玲珑

单位：杨嗣星　王玲珑　430060　武汉，湖北医科大学附属第一医院泌尿外科；张雪军　湖北襄樊市中心医院泌尿外科

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；维甲酸；细胞凋亡

　　【摘要】　目的　探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导人膀胱癌细胞T₂₄凋亡的可能性。方法　应用细胞和分子生物学技术检测不同浓度ATRA对T₂₄细胞生长和凋亡的影响。结果　3×10^-5～3×10^-7 mol/L ATRA可显著抑制T₂₄细胞增殖。用3×10^-5 mol/L和3×10^-6 mol/L ATRA作用细胞6天，可出现典型凋亡特征；3×10^-5、3×10^-6 mol/L ATRA组及对照组的细胞凋亡率分别为20.16%、15.31%和1.49%；DNA琼脂糖凝胶电泳呈现凋亡特征性的DNA梯形带。结论　ATRA对人膀胱癌细胞T₂₄有剂量生长抑制作用，且可成功地诱导人膀胱癌细胞T₂₄发生凋亡。

Apoptosis of human bladder cancer T24 cells induced by all-trans-retinoic acid

YANG Sixing, ZHANG Xuejun, WANG Linlong.

　　Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060

　　【Abstract】　Objective　To elucidate the effects of all-trans-retinoic acid (ATRA) on bladder cancer T24 cells and to establish the cell apoptosis model.Methods　The established human bladder cancer cells line T24 was cultured in RPMI 1640 medium with ATRA in the final concentrations of 3×10^－5 mol/L, 3×10^－6 mol/L and 3×10^－7 mol/L, respectively. After treating the cells for 6 days, the cells were analyzed regularly with multiple approaches for biological and morphological studies.Results　Either 3×10^－6 mol/L or 3×10^－7 mol/L ATRA could suppress cell growth and induce typical hallmarks of apoptosis after treating the cells for 6 days, the percentage of apoptosis cells of 3×10^－5, 3×10^－6 mol/L ATRA and control group was 20.16 %, 15.31 % and 1.49 % respectively on flow cytometry. A characteristic DNA “ladder” on agarose gels appeared in the treated group.Conclusion　ATRA significantly decreased T24 cell proliferation in a dose-dependent pattern. ATRA may induce sufficient apoptosis of human bladder cancer cell line T₂₄.

　　【Key words】　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Retinoic acid　　Apoptosis

　　为探讨维甲类化合物能否诱导人膀胱癌细胞发生凋亡，我们采用不同浓度的全反式维甲酸(ATRA)在体外作用于人膀胱移行细胞癌细胞株T₂₄，对被处理细胞的生长和凋亡特点进行观察，现报道如下。

　　材料和方法

　　1. 细胞培养及实验分组　膀胱癌T₂₄细胞(武汉大学中国典型培养保藏中心提供)在含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养液中，体积分数为5%CO₂、37℃条件下培养。实验按ATRA浓度不同分为3×10^－3、3×10^-4、3×10^-5、3×10^-6、3×10^-7、3×10^-8、3×10^-9、3×10^-10mol/L计8组及不加药对照和空白对照各2组。

　　2. 培养细胞形态观察及MTT测定　每日将处理组及对照组细胞置倒置相差显微镜下观察其生长情况。细胞培养48小时后，每培养孔加入5 g/L的MTT20 μl继续温育4小时后用酶联免疫检测仪测定其吸光值，并计算细胞生长抑制率。

　　3. 凋亡细胞的观察　经ATRA处理6天后的T24细胞经0.25%胰酶消化，细胞悬液离心后，取沉集细胞作荧光染色置荧光显微镜下镜检，计算细胞调亡发生率，并于透射电镜下观察细胞形态、细胞质及细胞核变化。

　　4. 流式细胞术(FCM)分析　收集经ATRA处理6天的T₂₄细胞经75%乙醇固定后，加入RNase 200 μl(1 g/L)作用30分钟，再加入80 μl PI染色液4℃避光染色30分钟，FAC Sort(美国，B.D公司)检测并用Lysis软件分析。

　　5. 细胞群染色体DNA断裂测定　收集处理6天的T₂₄细胞，加入细胞裂解液400 μl,经酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液抽提1次，4℃冷冻离心后，取其上清经无水乙醇抽提，离心，沉淀物干燥后，加TE50 μl，37℃水浴溶解2小时，2%琼脂糖内电泳分离，照像。

　　结果

　　1. 加入ARTA细胞培养至第4天，细胞形态无明显变化，第5天实验组可见少许变圆细胞脱壁浮起及少许细胞碎片浮起，至第6天细胞变化较第5天更为明显。MTT测定结果显示： 3×10^-3 mol/L及3×10^-4 mol/L组细胞大部分死亡(细胞杀伤率分别为76.31%、74.20%)；3×10^-5、3×10^-6、3×10^-7 mol/L组对T₂₄细胞有生长抑制作用，且呈剂量依赖关系。3组间差异有显著性(P＜0.01)；3×10^-8、3×10^-9、3×10^-10 mol/L组细胞无明显生长抑制作用，3组间差异无显著性(P＞0.05)。

　　2. 经ATRA处理6天的T₂₄细胞于荧光显微镜下可观察到凋亡细胞典型的凋亡核，即核碎裂形成多个凋亡小体或碎片。处理第2天、第4天的细胞凋亡偶见，第5天可见较多细胞凋亡，第6天凋亡细胞比例显著上升。计算3×10^-5、3×10^-6 mol/L组及对照组的细胞凋亡率分别为16.5%、15.2%和0.6%，对照组与处理组间差异有显著性(P＜0.05)，处理组两组间差异无显著性(P＞0.05)。3×10^-6 mol/L组细胞培养6天时，透射电镜下可见典型的细胞凋亡形态： 较多胞膜突起，胞质密度增强，核形态不规则，染色质浓缩凝集，胞质中出现柳叶状间隙以及凋亡小体形成。

　　3. 经ATRA处理6天的T24细胞流式细胞仪定量分析结果： 按Nicoletti^［1］报道正常二倍体DNA峰(G₁)之前出现的亚二倍体峰为凋亡峰，以此确定凋亡细胞百分率。3×10^-5、3×10^-6 mol/L组和对照组的细胞凋亡率分别达21.16%、15.31%和1.49%，对照组和处理组间差异有显著性(P＜0.01)，而处理组两组间差异无显著性(P＞0.05)。

　　4. 染色体DNA断裂测定结果： 3×10^-5、3×10^-6 mol/L组在琼脂糖凝胶电泳上均呈现凋亡特征性的DNA梯形条带，而对照组则不出现梯形条带。

　　讨论

　　Sawczuk^［2］曾报道，使用全反式和13-顺式维甲酸抑制原代培养膀胱癌细胞的生长。本研究发现，不同浓度全反式维甲酸对人膀胱癌细胞T₂₄细胞生长抑制程度不同。3×10^-3 mol/L和3×10^-4 mol/L组细胞生长抑制率达76.31%和74.20%，表明在此浓度范围内有明显的细胞毒性作用；而3×10^-8～3×10^-10 mol/L组与空白对照组相比其细胞生长抑制率差异无显著性，表明在此浓度范围内对T₂₄细胞无明显抑制作用；3×10^-5～3×10^-7 mol/L组均对T₂₄细胞有明显抑制作用，且呈剂量依赖性生长抑制。因此，我们认为，ATRA可抑制人膀胱癌细胞T₂₄的生长，其有效浓度为3×10^－5 mol/L～3×10^-7 mol/L，且具有剂量依赖性生长抑制的特点。

　　通过不同时间内观察ATRA处理的细胞形态变化，发现自ATRA作用5天开始呈现较多的细胞凋亡，第6天凋亡细胞明显增多，表现为ATRA作用的时间依赖性，该结果与ATRA诱导乳腺癌细胞凋亡发生的时间情况相似^［3］。细胞凋亡的典型生化改变是染色体DNA特征性的降解，表现在DNA琼脂糖凝胶电泳上有特征DNA梯形条带(DNA ladder)；此外，因凋亡细胞的DNA含量比正常细胞少，采用流式细胞仪测定细胞DNA含量亦为鉴定细胞凋亡的有效手段。本研究证实，经ATRA处理6天的细胞在琼脂糖凝胶电泳上呈现出典型的DNA梯形带，FCM分析结果处理组显著高于对照组。这些结果均提示ATRA可成功地诱导人膀胱癌细胞株T₂₄发生细胞凋亡。

　　注：本课题为湖北省科委重点发展项目(No.sk-96B79)

　　参考文献

　　1　Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immuno Method, 1991,139:271-279.

　　2　Sawczuk IS, Olsson CA, Mertz JR. Influence of retinoids on bladder cancer growth as detected by primary tissue culture. Br J Urol, 1990, 65:186-188.

　　3　Toma S, Isnardi L, Raffo P, et al. Effects of all-trans-retinoic acid and 13-cis-retinoic acid on breast-cancer cell lines: growth inhibition and apoptosis induction. Int J Cancer, 1997,70:619-627.

(收稿： 1999-05-12)