急性白血病患者p16及p15基因纯合子缺失及甲基化研究

中华血液学杂志 1999年第9期第20卷 论　著

作者：陈文明　张文艺　朱嘉芷　李利红　谭淑珍　夏成青　肖白　刘敬忠

单位：陈文明、朱嘉芷、李利红、谭淑珍、夏成青、肖白、刘敬忠　100020　首都医科大学附属北京红十字朝阳医院；张文艺　河北省廊坊市血液病研究所

　　关键词： 白血病；基因，p16；基因，p15；基因缺失；甲基化；细胞凋亡

　　摘要　目的　探讨血液系统恶性肿瘤患者p16及p15基因失活的发生率及其临床意义。方法　用聚合酶链反应(PCR)方法扩增p16及p15基因外显子1及外显子2，检测等位基因纯合子缺失；再用限制性内切酶-PCR方法检测p16及p15基因甲基化; 然后用TUNEL法(TdT-mediated dUTP-digoxygenin end-labeling)检测细胞凋亡。结果　56例患者中有p16和(或)p15基因失活者共33例，其中急性淋巴细胞白血病(ALL)38例中23例（占60.5%，T-ALL 12例, B-ALL 11例), ANLL 18例中10例(占55.5%)。ALL患者p16及p15基因均以甲基化失活为主。T-ALL失活的频率比B-ALL高。有p16和(或)p15基因失活者, 细胞的凋亡比例明显减少，病情进展迅速，治疗效果差，缓解率低, 缓解期明显缩短。结论　p16及p15基因失活的检测对于探讨急性白血病的发病机制，判断疾病进程有重要意义。

Homozygous deletion and methylation of p16 and p15 gene in acute leukemia

CHEN Wenming, ZHANG Wenyi, ZHU Jiazhi, et al.

　　Beijing Red-cross Chaoyang Hospital， Capital University of Medical Sciences,Beijing　100020

　　Abstract　Objective　To investigate the frequency of p16 and p15 gene inactivation in acute leukemia and to evaluate its clinical significance. Methods　Fifty-six patients with newly diagnosed acute leukemia was studied. PCR technique was used to detect homozygous deletion of p16 and p15 gene, restriction enzyme-PCR technique was used to detect gene methylation, and TdT-mediated dUTP-digoxygenin end-labeling (TUNEL) technique was used to detect cell apoptosis. Results　 p16 and /or p15 gene inactivation was detected in 33 of the 56 patients,including 23/38 (60.5%) of the ALL patients (T-ALL 12/16, B-ALL 11/22) and 10/18(55.5%) of the ANLL patients. For ALL patients, methylation was the major pathway of p16 and p15 gene inactivation. Patients with p16 and/or p15 gene inactivation had a delayed apoptosis, a poor response to chemotherapy, a lower remission rate and a shortened remission duration. Conclusion　The inactivation of p16 and p15 gene plays a key role in the pathogenesis of acute leukemia.

　　Key words　Leukemia　　Gene, p16　　Gene, p15　　Gene deletion　　Methylation　　Apoptosis

　　肿瘤的发生是多因素共同作用的结果，其中原癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活起着重要作用。1994年Kamb等^［1］在染色体9p21克隆出p16及p15基因。其编码产物p16及p15蛋白直接抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4及6(CDK4、CDK6)，阻断细胞周期而抑制细胞生长。血液系统恶性肿瘤有高频率的p16、p15基因失活^［2-4］。为进一步探讨急性白血病p16及p15基因失活的发生率及其与疾病的发生、发展及与细胞凋亡的关系，我们对56例急性白血病患者进行了p16及p15基因缺失及甲基化研究，并用TUNEL (TdT-mediated dUTP-digoxygenin end-labeling)法检测细胞凋亡。

　　对象和方法

　　1　研究对象

　　急性白血病患者56例,其中急性淋巴细胞白血病(ALL)38例(T-ALL 16例，B-ALL 22例)，急性非淋巴细胞白血病(ANLL) 18例(M₂ 11例，M₃ 4例，M₅ 3例)。所有患者均符合诊断标准^［5］。标本采自患者骨髓，20g/L的EDTA抗凝。所有患者骨髓幼稚细胞均大于0.80。

　　2　多重聚合酶链反应(PCR)检测p16纯合子缺失

　　2.1　DNA的提取：苯酚-氯仿法提取，用TE液溶解，调浓度为1μg/3μl。

　　2.2　多重PCR扩增检测纯合子缺失：根据文献［1］提供的引物系列，由中国科学院微生物研究所合成。引物系列分别为：p16基因外显子1:(S)5′GAAGAAAGAGGAGGGGCTG-3′，(AS)5′-GCGCTACCTGATTCCAATTC-3′，外显子2:(S)5′-GGAAATTGGAAACTGGAAGC-3′，(AS)5′-TCATCAGTCCTCACCTGAG-3′, 扩增片段长度分别为336bp及471bp。p15基因外显子1: (S)5′-CTGCGCGTCTGGGGGCTGC-3′，(AS)5′-CCTCCCGAAACGGTTGACTCC-3′，外显子2: (S)5′-CCCGGCCGGCATCTCCCATA-3′，(AS)5′-CGTTGTGGGCGGCTGGGGAACCT-3′, 扩增片段长度分别为163bp及351bp。并以β-珠蛋白基因作内对照，引物序列为:(S)5′-GGTACCTAATACGACTCACTATAGGGAGA-GACAGGTACGGCTGTCATC-3′， (AS)5′-CCCTTCCTATGACATGAAC-3′, 扩增片段长度为527bp。

　　在20μl反应体系中加入p16或p15基因外显子1及2引物各50pmol/L、4×dNTP各50μmol/L、Tris-HCl(pH8.0)、2.5mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl₂、1mmol/L DMSO、Tag酶1U、模板DNA 1μl。扩增p16基因外显子2 时加入β-珠蛋白引物作为内对照, 在PE 480(PE公司产品)中扩增。循环参数为95℃ 5分钟,72℃热启动，94℃1分钟,60℃1分钟,72℃1分钟(p16基因)或94℃　40秒,65℃　40秒,72℃　40秒(p15基因)，20个循环后72℃延伸10分钟。

　　3　限制性内切酶-PCR检测p16及p15甲基化

　　将患者DNA分别用甲基化敏感性限制性内切酶SmaⅠ或HpaⅡ在25℃消化过夜。经SmaⅠ消化的DNA用PCR扩增p16基因外显子1，经HpaⅡ消化的DNA用PCR扩增p15基因外显子1，扩增条件同上。如果经限制性内切酶SmaⅠ或HpaⅡ消化的DNA仍能扩增出外显子1，则判断为甲基化。

　　4　电泳

　　PCR扩增后产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳， 缓冲液为1×TAE。pBR322/MspⅠ作为分子标志。溴乙锭染色，紫外线扫描成像仪下观察摄片。

　　5　TUNEL法检测细胞凋亡

　　根据华美生物工程公司提供的方法进行。

　　6　统计学处理

　　两样本大小的比较采用t检验, 两组率的比较用χ²检验，配对资料用配对χ²检验。

　　结 果

　　我们对56例急性白血病患者进行了p16基因及p15基因纯合子缺失及甲基化研究, 结果发现: 在急性白血病患者中, 存在多种形式的基因失活, 包括单基因的缺失、甲基化或二基因同时缺失、甲基化。

　　56例患者中有p16、p15基因失活者共33例，其中ALL 38例中23例, ANLL 18例中10例（表1）。

　　1　ALL组基因缺失

　　38例患者中, p16、p15基因失活者23例, T-ALL 16例中有12例(占75%), B-ALL 22例中有11例(占50%)，T-ALL失活的频率比B-ALL高，但经统计学处理，差异无显著性。12例p16及(或) p15失活T-ALL患者中, 同时有二基因失活者9例, 其中同时甲基化6例，同时缺失者2例, p16基因缺失及p15基因甲基化1例；单纯p15基因甲基化3例。11例p16、p15失活B-ALL患者中, p15基因甲基化者11例, 3例伴有p15基因外显子2缺失, p16基因甲基化7例, p16基因缺失1例，本组无双基因同时缺失者。结果显示：ALL p16、p15基因主要以甲基化方式失活为主, 在有失活的23例患者中, 有p16和（或）p15基因甲基化者达21例, 明显高于以缺失方式失活的患者(P＜0.001)。

　　2　ANLL组基因缺失

　　18例患者中, p16、p15基因失活者10例(占55.5%), 其中M₂ 6例, M₃ 2例, M₅ 2例。 此10例患者均有p15基因失活（缺失4例, 甲基化6例），p16基因失活同时发生于6例患者中（缺失1例，甲基化5例）。

　　3　细胞凋亡检测结果

　　随机研究20例患者，其中ALL 10例，ANLL 10例，结果发现：有p16或(和)p15基因失活的12例患者骨髓细胞的凋亡与无p16或(和)p15基因失活的8例患者比较，细胞凋亡比例明显减少，其凋亡指数(AI)［(0.100±0.122)%］比

表1　56例急性白血病患者p16、p15基因失活情况

　　无p16或(和)p15基因失活者［(0.310±0.410)%］明显降低(P＜0.01)。4　p16、p15基因失活与预后

　　p16、p15基因失活发生于多种类型血液系统肿瘤中，且有p16、p15基因失活者病情进展迅速，治疗效果差, 缓解率低(PR+CR为45.4%), 缓解期明显缩短(平均缓解期8.6个月)。有p16、p15基因失活者33例中, 同时有p16及p15基因失活者22例, 此类患者经化疗仅6例取得缓解, 但缓解后很快复发。

　　对2例患者随访研究发现：1例B-ALL患者，初发时p16、p15基因未发现异常，治疗后达到完全缓解，但当疾病复发时，出现p16、p15基因甲基化。1例M₅患者初发时，有p15基因外显子1，2缺失, 经治疗缓解后复发时, 合并有p16基因甲基化。

　　无p16、p15基因失活的23例患者中，19例经治疗后达到缓解(PR+CR)，缓解率为82.6%, 缓解期22.5个月。与有p16、p15基因失活者比较，差异非常显著（P＜0.001)。

　　讨论

　　丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(CDKs)、细胞周期蛋白(cyclin)和p16、p15形成一个动态平衡，控制细胞周期过程。一方面，cyclin D与CDK4、6结合并激活之，使底物PRB蛋白磷酸化，而激活某些转录因子(如E2F)，使细胞由G₁→S期; 另一方面, p16、p15蛋白与cyclin D具有竞争性与CDK4、6结合的特点, p16、p15蛋白与cyclin D竞争性与CDK4、6结合,抑制CDK4、6活性, 使PRB不能被磷酸化而保持活化状态， 阻止细胞由G₁→S期的过渡。p16、p15基因的失活，引起G₁期缩短, 细胞周期加速, 特别是DNA在没有修复前过早地进入S期, 可能是细胞恶性转化的关键^［6］。

　　我们用TUNEL法检测细胞凋亡。由于凋亡细胞的内源性核酸内切酶被激活, 细胞自身的染色体或DNA断裂，出现与断点数目相同的3′-羟基末端。末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)可以将生物素化的dUTP(Biotin-11-dUTP)标记至3′-羟基末端, 该生物素可以通过与亲和素-辣根过氧化酶(Avidin-HRP)结合在DNA断点部位, 加入HPR显色底物后在原位出现有色沉淀, 从而可以在显微镜下观察到被着色的凋亡细胞。我们对血液系统恶性肿瘤的研究同样发现：有p16或（和）p15基因失活的患者骨髓细胞的凋亡与无p16或（和）p15基因失活者比较明显延缓, 其AI比无p16或(和)p15基因失活者明显降低。

　　p16、p15基因的缺失与恶性肿瘤的细胞类型有关。ALL有高频率的p16和(或)p15基因缺失, T-ALL比B-ALL更高，可达70%以上。表明p16基因缺失与T淋巴细胞白血病的发生有关, 其机制不明, 可能是在淋巴细胞中p16缺失与重组酶活性有关。

　　我们用甲基化敏感的限制性内切酶SmaⅠ或HpaⅡ对患者DNA进行消化，37例患者于消化后仍可扩增出p16、p15基因外显子1, 表明有该基因甲基化。证明在血液系统恶性肿瘤发生、发展过程中, p16、p15基因失活主要是由于p16、p15基因甲基化所致。最近, 国外有学者正试验用去甲基化药物5-azacytidine及5-aza-2′-deoxycytidine治疗有p15或p16基因甲基化的急性白血病^［7，8］, 结果令人鼓舞, 此研究为血液系统恶性肿瘤的治疗提供了新的途径。

　　基金项目：本课题受北京市科干局青年基金资助

　　参考文献

　　1　Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994, 264:436-440.

　　2　Hayette S, Thomas X, Bertrand Y, et al. Molecular analysis of cyclin dependent kinase inhibitors in human leukemia. Leukemia, 1997, 11:1696-1699.

　　3　Zhou M, Gu L, Yeager AM, et al. Incidence and clinical significance of CDK2/p16 and MTS2/p15 gene deletion in childhood acute lymphoblastic leukemia. Pediatr Hematol Oncol, 1997, 14:141-150.

　　4　Diccianni MB, Batova A, Yu J, et al. Shortened survival after relapse in T-cell acute lymphoblastic leukemia patients with p16/p15 deletions. Leuk Res, 1997, 21:549-558.

　　5　张之南，沈悌，主编. 血液病诊断及疗效标准. 第2版. 北京：科学出版社，1998. 171-193.

　　6　Hirama T, Koeffler HP. Role of the cyclin-dependent kinase inhibitors in the development of cancer. Blood,1995，86:841-854.

　　7　Herman JG, Jen J, Merlo A, et al. Hypermethylation-associated inactivation indicates a tumor suppressor role for p15 (INK4B). Cancer Res, 1996, 56:722-727.

　　8　Otterson GA, Khleif SN, Chen W, et al. CDKN2 gene silencing in lung cancer by DNA hypermethylation and kinetics of p16^INK4 protein induction by 5-aza-2′-deoxycytidine. Oncogene, 1995, 11:1211-1216.

收稿：1998-09-30

　　修回：1999-03-02