IL-2联合BCG膀胱灌注预防膀胱癌复发的机理研究

中华泌尿外科杂志 1998年第4期第19卷 论　　著

作者：王军起　连保罗　谢叔良

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；灌注法

　　摘要　为探讨IL-2联合BCG膀胱灌注预防膀胱癌术后复发的机制，对比研究了IL-2和BCG联合灌注与单用BCG灌注前后患者血、尿中TNFα水平的动态变化，并测定IL-2对膀胱癌BIU-87细胞株细胞膜TNFα受体的影响。结果发现：联合灌注组的TNFα水平显著高于BCG组，且IL-2诱导后细胞膜TNFα受体表达明显增加。提示联合灌注组机体的细胞免疫功能得到更好的改善，IL-2增加了肿瘤细胞对免疫反应的应答，二者间有免疫促进及协同作用。

　　The mechanism of intravesical instillation of IL-2 together with BCG in the prevention of bladder cancer recurrence　Wang Junqi, Lian Baoluo, Xie Shuliang. Department of Urology, the affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002

　　Abstract　Intravesical instillation of BCG alone or together with IL-2 was carried out in patients of bladder cancer undergone surgical operation and changes of serum and urine TNF level were studied respectively. The effect of IL-2 on the expression of membrane TNF receptors in cultured BIU-87 bladder carcinoma cells was also investigated. Levels of TNF were found to increase significantly after the combined instillation of BCG and IL-2, the latter inducing more expression of membrane TNF receptor. The result suggested that intravesical instillation of BCG together with IL-2 would improve the cell immunological function and IL-2 would improve the immunological response of the tumor cells.

　　Key words　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Perfusion

　　IL-2联合BCG膀胱灌注预防膀胱癌复发的临床效果优于单用BCG灌注^［1～3］，但其机制研究不多。我们在1995年9月～1996年11月采用膀胱灌注法治疗膀胱肿瘤20例，从肿瘤坏死因子(TNFα)及其受体的角度，探讨了其抗肿瘤作用机理。

材料与方法

　　20例膀胱癌患者。年龄35～72岁，平均51岁。行膀胱部分切除术12例，TURBt 8例，术后均经病理证实为移行细胞癌。其中Ta 3例，T₁ 8例，T₂ 9例。术后15日采取血、尿标本后随机分为两组行膀胱灌注，10例单用BCG 120mg，另10例用IL-2 2万U加BCG 60mg，各用20ml生理盐水稀释后灌注，灌前排空膀胱，灌后变换体位，保留2小时，每周一次。

　　第6次灌注后8小时及一周时分别采静脉血，取血清保存于-20℃；第4、8、24小时及1周时，分别无菌留取尿液，2 000转/分离心20分钟，取上清保存于-20℃。

　　BIU-87细胞用含有10%小牛血清的RPMI 1 640完全培养基于37℃、5%CO₂培养箱内培养，反复传代增加细胞数，将其中一部分细胞直接进行受体测定，另一部分细胞传代后用含有不同浓度的IL-2的RPMI 1 640培养基继续培养，其中IL-2浓度为100U/ml的培养基分瓶分别培养1、3、7、11、20天，用浓度为10、1 000、2 000U/ml的培养基分别培养7天，按时收获细胞进行受体测定。

　　BCG(每支含60mg，冻干制品)由兰州生物制品研究所提供，临床用重组IL-2由北京四环生物制品厂提供，实验用IL-2由北京邦定生物医学公司提供，TNFα标准品(活性为2×10⁷U/mg)和¹²⁵I标记的TNFα(比活度为2590 kBq)均由中国原子能研究院提供，膀胱癌BIU-87细胞株由北京医科大学泌尿外科研究所提供。

　　血清和尿中TNFα活性测定用细胞生物学结晶紫染色法^［4］。BIU-87细胞膜TNFα受体测定用放射配基结合分析法^［5］。

　　TNFα测定结果以x±s表示，采用成组t检验。

结　　果

　　一、灌注前后血TNFα水平的比较

　　20例患者灌注前TNFα为98.28±30.29U/ml。10例BCG灌注组灌注前TNFα为97.45±31.72U/ml，灌注后6小时及1周时分别为119.90±32.04和104.42±38.69U/ml，与灌注前相比无显著性差异(P＞0.05)；IL-2联合BCG灌注组灌注前的TNFα为98.51±29.94U/ml，灌注后6小时及1周时分别为151.32±57.35和139.90±46.58U/ml，与灌注前相比有显著性差异(P＜0.05)。

　　二、灌注前后尿TNFα水平的比较

　　20例患者灌注前尿TNFα为0.81±0.29U/ml。BCG灌注组灌注前TNFα为0.78±0.20U/ml，灌注后4、8、24小时及1周时分别为1.83±0.58、1.57±0.33、1.13±0.51、0.86±0.26U/ml，灌注后24小时内的尿TNFα水平与灌注前有显著性差异(P＜0.05)，至1周时无显著性差异(P＞0.05)；IL-2联合BCG灌注组灌注前水平为0.82±0.32U/ml，灌注后4、8、24小时及1周时分别为2.58±0.93、2.01±0.76、1.67±0.38、1.26±0.57U/ml，灌注后24小时内尿TNFα水平与灌注前相比差异有显著性(P＜0.01)，且至1周时仍有显著性差异(P＜0.05)，并分别高于BCG组灌注后水平(P＜0.05)。

　　三、IL-2对BIU-87细胞膜TNFα受体的影响

　　实验发现膀胱肿瘤BIU-87细胞膜存在TNFα受体，结合反应曲线为饱和双曲线型，Scatchard分析作图为一直线，并可算出每个细胞膜的TNFα受体数为869个。IL-2作用后，受体表达明显增加，TNFα与受体的特异性结合率随着IL-2浓度增加而升高，并随着作用天数的增多而增加，且以浓度为1 000U/ml、作用7天时达最高。

讨　　论

　　膀胱肿瘤患者的免疫功能低下，且术后不能自主恢复，因此提高机体免疫力预防肿瘤复发是治疗的重要步骤。BCG治疗膀胱癌和预防复发已取得了肯定的疗效，IL-2联合BCG膀胱灌注可明显提高疗效^［1］。Merguerian等^［2］报告应用于13例膀胱肿瘤病人，有效率达93%，11例11个月无肿瘤复发，而单用BCG的有效率为63%。IL-2被认为是BCG抗肿瘤作用的一部分，只有两者同时起作用，才能显著增强宿主的免疫细胞活性^［6］。

　　TNF是迄今发现的抗肿瘤作用最强的细胞因子，对病情预后有重要意义。靳凤烁等^［7］发现免疫治疗后TNF水平升高不明显或反而下降者是复发的高危患者。从本实验结果看，IL-2联合BCG膀胱灌注后血、尿TNFα水平均显著升高，且1周时水平仍高于灌注前；而BCG灌注后只有尿TNFα水平有显著升高，且灌注后24小时已降至接近灌注前，维持时间短。说明BCG增加了膀胱局部的免疫功能，但对机体全身的免疫状态影响较小，而IL-2联合BCG不仅增加了局部免疫功能，而且提高了全身免疫状态，并能维持较长时间，这更利于在膀胱灌注期间的间期延长时仍保持较高的免疫状态。而BCG灌注后复发率高可能与灌注间期延长时的免疫力低有关。

　　TNF必须和细胞膜受体结合后才能产生细胞毒作用。本实验说明膀胱肿瘤细胞膜存在TNF受体，而IL-2作用后可以增加受体与TNFα的特异结合率，反映了受体数表达的增加，从而增强了TNF作用，达到了直接破坏肿瘤细胞的作用，且这种作用随着IL-2浓度的增加而增强。目前文献报告的IL-2用量均在3 500～20 000U，进一步增加剂量后的疗效有待进一步观察。BCG本身也可使肿瘤细胞产生超微结构损伤，如光面与粗面内质网扩张，细胞器肿胀或空泡变性、核固缩变化^［8］，二者共同作用不仅更好地改善了机体的免疫功能，且可直接破坏术后膀胱内残余癌细胞及复发瘤细胞，达到治疗效果。

　　值得注意的是，有一些肿瘤细胞膜表面无TNF受体或虽然存在受体但对TNF的细胞毒性作用具有耐受性，并不能被调节^［9］，这类肿瘤的免疫治疗效果较差。

　　在治疗过程中，联合灌注的10例病人(平均8.5个月)无1例复发，用BCG灌注的10例病人(平均8.3个月)中，有2例分别在4个月和6个月时发现尿脱落细胞阳性，膀胱镜检发现有0.3～0.5cm大小的乳头状瘤体，均改用联合灌注，分别于两个月时尿脱落细胞转为阴性，膀胱镜检发现瘤体消失。且BCG灌注后的并发症如尿频、尿急、发热等在联合灌注组明显减轻或消失，病人完全可以耐受。

　　因此，IL-2联合BCG膀胱灌注更好地改善了机体的细胞免疫状态，提高了肿瘤细胞对免疫反应的应答，促进了肿瘤细胞的破坏，有着较好的疗效。

参　考　文　献

　　1　Dow jA, Anthony P, Cockett ATK. Expression of blood group precursor T antigen as a prognostic marker for human bladder cancer treated by BCG and IL-2. J Urol, 1989,142∶978.

　　2　Merguerian P A, Donahue L, Cockett ATK. intralumical IL-2 and BCG for treatment of cancer: a preliminary report. J Urol, 1987,137∶216.

　　3　苟欣，肖明朝，何梓铭.BCG和IL-2膀胱灌注预防膀胱癌复发的疗效观察.中华泌尿外科杂志，1996，17∶91.

　　4　林民专，高传，王希民，等.TNF活性测定在同种异体肾移植中的临床意义.中华泌尿外科杂志，1995，16∶463.

　　5　夏宗勤主编.实验核医学与核药学.上海：同济大学出版社，1989，220.

　　6　Sonsnowski JT, Haven JI, Abraham FM, et al. sequential immunocytological evaluation of murine transitional cell carcinoma during BCG and IL-2 immunotherapy. J Urol, 1992,147∶1439.

　　7　靳凤烁，方玉华，邓晓洪，等.血TNF水平及IL-2膀胱灌注对膀胱癌预后的意义.中华泌尿外科杂志，1993，14∶190.

　　8　韩瑞发，马腾骧，董亚利，等.BCG对膀胱粘膜结构的影响及肿瘤超微病理的研究.中华泌尿外科杂志，1995，16∶208.

　　9　Sugarmen BJ, Aggarwal BB, Hass PE, et al. recombinant TNF-alpha: effects on proliferation of normal and transformed cells in vitro. science, 1985, 230∶943.