膀胱癌中bcl-2和p16基因的表达与预后的关系

　　中华外科杂志2000年第38卷第1期

冷江涌　张亚正　姚旭东　温凯胜

　　 摘　要　目的：探讨bcl-2和p16基因蛋白在膀胱癌的表达与预后的关系。方法：采用SABC法对51例膀胱癌组织和5例正常膀胱粘膜行bcl-2和p16基因表达的检测。结果：bcl-2在膀胱癌的阳性表达率为80.2％(42/51)。生存组和死亡组之间比较差异有显著性意义(P＜0.05)。p16在膀胱癌的阳性表达率为50.9％(26/51)。5例正常膀胱粘膜均阳性，两者比较差异有显著性意义(P＜0.05)。在病理分级、临床分期和预后的总样本率中比较差异有显著性意义(P＜0.05)；即随病理分级临床分期的上升和预后的不良，p16的阳性表达下降。bcl-2阳性而p16阴性(21例)的分布随病理分级、临床分期的上升和预后不良而上升(P＜0.05)。bcl-2和p16都阳性(22例)的分布，随病理分级、临床分期升高和预后不良而下降(P＜0.05)。结论：原癌基因bcl-2过度表达和抑癌基因p16缺失突变与膀胱癌的发生发展及预后有密切关系。可作为评估膀胱癌恶性程度及预后的指标。

　　 关键词：膀胱肿瘤　癌基因　基因表达　预后

　　膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，具有复杂的生物学行为，临床上有不同的表现形式和截然不同的预后。其高复发率和浸润转移一直是基础和临床研究的重要课题。本研究应用免疫组化(SABC)法，对51例膀胱癌和5例正常膀胱粘膜标本进行bcl-2和p16基因蛋白的检测。探讨这两种基因的表达与膀胱癌临床、病理和预后的关系。

　　资料与方法

　　1．实验标本：选取我院泌尿外科手术治疗的并已随访5年以上有完整资料的原发性膀胱癌石蜡包埋标本51例。其中膀胱全切术9例，膀胱部分切除术16例，TURBt26例。保留膀胱手术者术后均行BCG或BCG加丝裂霉素膀胱灌注。男43例，女8例，年龄28～72岁，平均53.4岁。按照WHO和UICC标准进行组织学分级和临床病理分期。病理分级：Ⅰ级11例、Ⅱ级26例、Ⅲ级14例。临床分期：Tis～T₁期28例、T₂期17例、T₃期6例。根据随访结果将病人分为A、B、C3组，A组为5年未复发的20例，B组为5年至少有1次复发的16例，C组为5年内死于膀胱癌的15例。

　　2．试剂：Bcl-2(N-19)兔抗人多克隆抗体和p16(C-20)兔抗人多克隆抗体为美国SantaCruz公司产品；SABC(SA-4012)免疫组化Kit为武汉博士德公司产品，DAB为美国Sigma公司产品。

　　3．采用SABC免疫组化法：4 μm连续石蜡切片4张(1张做HE染色),1∶50一抗(bcl-2或p16)，1∶100稀释生物素化二抗和1∶100稀释SABC(streptavidin biotin-peroxidae complex)三抗；DAB显色液：Mayor苏木素复染30 s。实验中采用已知乳腺癌组织作为bcl-2和p16阳性对照。5例正常粘膜(取自因骨盆骨折尿道断裂行尿道会师术中正常膀胱粘膜)作为正常对照。PBS替代一抗为阴性对照。

　　4．结果判定：bcl-2在肿瘤细胞膜或细胞浆内出现棕色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数多于10%为阳性病例。p16阳性反应为细胞浆或细胞核被染成棕黄色，主要为细胞浆染色。统计检验方法采用多个样本间比较的秩和检验和样本间两两比较的秩和检验。统计软件(PEMP2.0 version)。

　　结　果

　　1．bcl-2：（1）51例膀胱癌标本中bcl-2蛋白阳性表达42例，占80.2%(42/51)。5例正常粘膜仅1例弱阳性，两者比较差异有显著性意义(P＜0.05)。（2）病理分级、临床分期和预后各组中bcl-2蛋白阳性表达情况见表1。病理分级、临床分期之间比较均无显著性差异(P＞0.05)。预后总样本率之间比较差异有显著性意义(P＜0.05)。即存活和死亡组之间比较差异有显著性意义(P＜0.05)。

表1　bcl-2表达与膀胱癌病理分级、临床分期及预后的关系(例)

　　 2．p16蛋白：（1）51例膀胱癌组织中p16蛋白阳性表达26例，占50.9％(26/51)。5例正常膀胱粘膜均为阳性，两者间比较差异有显著性意义(P＜0.05)。（2）p16在病理分级、临床分期和预后各组中的表达情况见表2。其之间比较差异均有显著性意义(P＜0.05)。

表2　p16表达与膀胱癌病理分级、临床分期及预后的关系(例)

　　 3．两种基因表达的组合在膀胱癌病理分级、临床分期和预后各组中的分布见表3。

表3　bcl-2和p16表达与膀胱癌病理分级、临床分期及预后的关系

　　 （1）bcl-2蛋白阳性而p16蛋白阴性表达者20例，在病理分级、临床分期和预后各组总样本率之间比较差异均有显著性意义(P＜0.05)。（2）bcl-2和p16蛋白同时阳性表达者22例，在病理分级、临床分期和预后各组总样本率之间比较差异均有显著性意义(P＜0.05)。

　　讨　论

　　程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)或谓之细胞凋亡(apoptosis)，在控制细胞增殖、肿瘤的发生及生长中起重要作用^［1］。可将癌症设想为一个简单的平衡问题，即细胞的累积率等于细胞的增殖率减去细胞的死亡率^［2］。显而易见，或者是增加细胞的分裂率，或者是减少细胞的死亡率，才有剩余细胞的积累。因此，引起肿瘤的原因就不仅仅局限在细胞增殖方面，细胞死亡的改变也起相当重要的作用。

　　bcl-2被认为是特异地抑制细胞凋亡的所谓存活基因(suvival gene)，在PCD调控中最具重要意义^［3］。它能抑制许多类型细胞的PCD，保护正常细胞和癌细胞免于各种诱导剂诱发的程序性细胞死亡^［4］。bcl-2是一种原癌基因，它不影响细胞增殖，而是作为细胞凋亡的抑制剂调节细胞死亡。此外，肿瘤细胞对抗肿瘤药物和激素治疗产生的耐药性可能与bcl-2高表达有关。Miyashita等^［5］观察了bcl-2基因表达对一些常用抗癌化疗药物治疗效果的影响,结果表明,当肿瘤细胞与常用化疗药物共同培养时,bcl-2表达的增加能显著延长细胞的存活期及明显减少DNA的破裂。这说明bcl-2表达的增加阻断了某些化疗药物诱导的肿瘤细胞的细胞凋亡，在肿瘤细胞抗药性形成过程中起一定作用。但有关膀胱癌术后行腔内化疗后复发与bcl-2表达的关系还未见有报道。

　　除了血液系统外，在多种肿瘤组织都有检出bcl-2的报道。如乳腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌等。窦中岭等^［6］检测49例膀胱癌石蜡标本,结果在各级和各期膀胱癌中均有bcl-2表达,并随病理分级及临床分期的增高,bcl-2表达也增高,但差异无显著性意义。本组bcl-2蛋白总表达率是80.2％(42/51)。而在病理分级之间以及临床分期之间差异均无显著性意义(P＞0.05)，说明bcl-2高表达在膀胱癌组织中是一个普遍现象。bcl-2表达与预后的关系在生存组与死亡组之间比较差异有显著性意义(P＜0.05)，说明bcl-2可作为膀胱癌预后的一项指标。有资料显示多数恶性肿瘤包括尿路移行上皮癌中bcl-2表达可作为独立的预后因子^［7］。

　　p16基因(MTS1,CDK4I,CDKN2)是一种新近发现的参与细胞周期调控的抑癌基因。其位于9号染色体短臂21区(9p21)上^［8］。研究发现，p16基因缺失或突变在人恶性肿瘤中普遍存在。Kamb等^［9］检测了来源于肺、乳腺、膀胱、肾、脑等290种不同肿瘤细胞系，发现有75％的细胞系有p16蛋白的缺失或突变，其中在膀胱癌细胞系中的缺失和突变率为33％。我们对51例膀胱癌石蜡标本检测抑癌基因p16的表达。总阳性率50.9％(26/51)。p16蛋白阳性表达在病理分级和临床分期样本率比较中差异有显著性意义(P＜0.05)，提示p16蛋白的表达与膀胱癌的恶性程度有关，随肿瘤恶性程度的上升，p16蛋白的阳性表达率下降。表浅性和早期膀胱癌中p16蛋白阳性表达率高于浸润性和晚期肿瘤。在生存组中，未复发者和复发者p16蛋白阳性表达率比较在统计学上差异无显著性意义，但生存组与死亡组阳性表达率之间比较差异有显著性意义(P＜0.05)，提示p16蛋白表达阳性率与预后之间有关。总之p16蛋白低表达是膀胱癌的晚期指征。其缺失和突变可能是膀胱癌由表浅性转变为浸润性的重要因素。所以p16蛋白的表达可作为膀胱癌的预后指标。

　　bcl-2和p16协同表达与膀胱癌的关系。不少研究者提出了细胞癌变的多基因协同作用学说。认为至少有两个或两个以上功能不同的癌基因的激活，才有可能引起细胞的癌变。

　　bcl-2阳性和p16阴性与膀胱癌的关系。本研究对原癌基因bcl-2蛋白阳性表达同时抑癌基因p16蛋白阴性表达，在膀胱癌分级分期及预后中的分布及意义做了探讨。结果显示bcl-2阳性及p16阴性共20例。在病理分级，临床分期及预后中总样本率比较差异均有显著性意义(P＜0.05)。随病理分级增高和临床期别的增高，bcl-2阳性，p16阴性的分布也增多。而在存活组和死亡组之间比较两者差异有显著性意义(P＜0.05)。

　　bcl-2阳性p16也阳性在本组共22例，他们在病理分级，临床分期及预后中的分布差异均有显著性意义(P＜0.05)，即随着病理分级和临床分期的上升及预后的不良，其共同表达率在下降。

　　以上结果表明原癌基因bcl-2的过度表达与抑癌基因p16的缺失突变与膀胱癌的发生发展及预后有密切关系。可做为判断该肿瘤恶性程度自然病程及预后的估价指标。

　　作者单位：冷江涌　010050　呼和浩特，内蒙古医学院第一附属医院泌尿外科

　　张亚正　010050　呼和浩特，内蒙古医学院第一附属医院泌尿外科

　　姚旭东　010050　呼和浩特，内蒙古医学院第一附属医院泌尿外科

　　温凯胜　010050　呼和浩特，内蒙古医学院第一附属医院泌尿外科

　　参考文献

　　［1］Williams GT, Smith CA. Molecular regulat ion of apoptosis:genetic controls on cell death. Cell,1993,74:777-779.

　　［2］Reed JC.Bcl-2 and the regulation of programmed ce ll death. J Cell Biol,1994,118:1-6.

　　［3］Hockenbery D, Nunez G, Milliman C,et al. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death. Na ture,1990,348:334-336.

　　［4］Korsmeyer SJ. Bcl- 2 initiates a new category of onc ogenes: regulators of cell death. Blood,1992,80:879 -886.

　　［5］Miyashita T, Reed JC. Bcl-2 oncoprotein blocks chemo therapy-induced apoptosis in a human leukemia cell line. Blood, 1993,81:151 -157.

　　［6］窦中岭,周四维.抗凋亡基因bcl-2在膀胱肿瘤中的表达及意义.临床泌尿外科杂志，1998,13:506-508.

　　［7］Bilim V, Tomita Y,Kawasaki T, et al. Prognostic val ue of bcl-2 and p53 expression in urinary tract transitional cell cancer. J Natl Cancer Res, 1996,88:686-689.

　　［8］Nobori T, Miura K, Wu DJ, et al. Deletions of the cyclindependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancer. Natur e, 1994,368:753-756.

　　［9］Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J. A cell cycle re gulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,2 64:436-440.