人膀胱癌BIU-87/ADM细胞中Bcl-2基因的原位表达

　　第三军医大学学报2000年第22卷第1期

王祥卫　杨唐俊　何斌　金欢胜　曾毅　刘素英

　　摘　要　目的：探讨人膀胱癌多药耐药机制。方法：应用原位杂交和免疫细胞化学技术，分别对人膀胱癌耐药细胞株(BIU-87/ADM)及敏感细胞株(BIU-87)中Bcl-2基因及其产物的表达进行研究。结果：BIU-87/ADM细胞Bcl-2基因表达呈强阳性(++)，BIU-87细胞呈弱阳性(＋)。结论：凋亡抑制基因Bcl-2在人膀胱癌多药耐药细胞中的高表达，与人膀胱癌多药耐药的产生有关。

　　关键词：细胞凋亡；多药耐药；原位杂交

　　耐药是肿瘤化疗失败的主要原因，多药耐药(Multidrug resistance,MDR)是肿瘤细胞发生耐药的主要形式。深入研究其发生机制，不仅有重要的理论意义，而且有潜在的临床应用价值。目前，细胞凋亡的研究较多，但是，有关细胞凋亡与膀胱癌多药耐药的研究未见报道。因此，本课题试图从细胞凋亡的角度探讨膀胱癌多药耐药的发生机制。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞株及细胞培养

　　人膀胱癌BIU-87细胞株引自北京医科大学泌尿外科研究所。耐药细胞株BIU-87/ADM，由我科应用阿霉素大剂量冲击结合低浓度诱导敏感细胞株BIU-87所建立(1994年)。细胞置于于含5％CO₂、37℃、饱和湿度的孵箱中培养，每3d换培养液1次；细胞长成单层后，用0.25％胰蛋白酶消化、传代。

　　1.2　试剂

　　含人Bcl-2 cDNA的质粒pUC19/B₄(简称pB₄质粒)由日本大坂大学医学院生物医学研究中心Tsujimot教授惠赠。鼠源性抗人Bcl-2单克隆抗体(Bcl-2-100)，由Dr.David mason(John Radcliffe Hospital,Headington,英国)惠赠。ABC试剂盒(华美生物工程公司)。

　　1.3　原位杂交^［1］

　　1.3.1　Bcl-2 cDNA探针的合成　　将含人Bcl-2 cDNA的质粒pB₄转化、提取、纯化、限制性酶切分析及回收探针。应用地高辛标记试剂盒进行探针标记。

　　1.3.2　原位杂交　原位细胞生长片，4％多聚甲醛固定15min，0.1mol/L盐酸作用5min，2.5mg/L蛋白酶K，37°C，作用15min，70％甲酰胺/1×SSC,40°C，变性15min，冷乙醇梯度脱水。每片滴加20μl杂交液(含变性cDNA探针50ng，10％甲酰胺，0.5g/L鲑鱼精DNA，2.5×Danhardt液，10％硫酸葡聚糖，0.05mol/LDTT，2×SSC)，盖硅化盖玻片，37°C孵育24h，依次用2×SSC，1×SSC，0.5×SSC及PBS漂洗，滴加1∶1000Dig-Ab，37℃，30min，NBT/BCIP显色。阴性对照杂交液不加探针。阴性不着色(－)，呈浅蓝色者为弱阳性(＋)，呈深蓝色或深紫色者为强阳性(＋＋)。

　　1.4　免疫细胞化学

　　应用ABC法。呈棕黄色为Bcl-2蛋白阳性，不着色为阴性；同时应用PBS代替一抗，作为阴性对照。

　　2　结果

　　2.1　Bcl-2mRNA的表达

　　2.1.1　Bcl-2 cDNA片段的鉴定　　含人Bcl-2 cDNA的质粒pB₄转化经EcoRI酶切，电泳鉴定酶切片段长度为0.95kb，见图1。

图1　Bcl-2 cDNA酶切片段的鉴定

　　1：pB₄质粒；　2：EcoRI酶切质粒；

　　3：λDNA EcoRI/Hind Ⅲ Marker

　　fig1　Identification of Bcl-2 cDNAfragment

　　digested by EcoRI

　　1：pB4 plasmid;2:pB4 plasmid digested by EcoRI;

　　3:λDNA EcoRI/Hind Ⅲ Marker

　　2.1.2　原位杂交　　BIU-87/ADM及BIU-87细胞内均有Bcl-2mDNA阳性杂交信号，呈现为紫蓝色颗粒状着色，主要见于胞浆，以核周胞浆区更明显。BIU-87/ADM细胞呈强阳性(++)，BIU-87细胞呈弱阳性(＋)，见图2、3。

图2　BIU-87细胞Bcl-2原位杂交结果　(×400)

　　fig2　Results of in situ hybridization of Bcl-2

　　gene in BIU-87 cells　(×400)

图3　BIU-87/ADM细胞Bcl-2原位杂交结果　(×400)

　　fig3　Results of in situ hybridization of Bcl-2 gene

　　in BIU-87/ADM cells　(×400)

　　2.2　Bcl-2蛋白的表达

　　BIU-87/ADM及BIU-87细胞内均有Bcl-2蛋白的表达，Bcl-2蛋白主要定位于胞浆，核膜亦有表达；耐药细胞BIU-87/ADM中Bcl-2蛋白表达强阳性(++)，BIU-87细胞呈弱阳性。

　　3　讨论

　　肿瘤细胞的多药耐药(Multidrug resistance,MDR)是临床肿瘤化疗的严重障碍，深入研究其发生机制及其逆转途径具有重要的意义。为此，我们曾应用阿霉素(Adriamycin,ADM)诱导人膀胱癌敏感细胞株BIU-87，成功地建立了耐药细胞株BIU-87/ADM^［2］，并进行了逆转的实验研究^［3］。

　　随着细胞凋亡研究的深入，人们发现许多化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗癌效应的。细胞凋亡是一种主动的细胞死亡形式，主要表现为形态学变化及DNA的断裂。前者包括胞浆固缩、体积变小、胞核致密以及形成凋亡小体；后者主要是由于细胞内核酸内切酶的激活，在核小体之间切断DNA，形成大量200bp倍数的DNA断片，电泳可出现梯形改变。原位DNA末端转移酶标记法可检测凋亡细胞，尤其是对早期凋亡细胞的检测敏感性强，结合细胞的形态学变化，特异性较强。我们应用该方法发现阿霉素可诱导人膀胱癌细胞凋亡；我们同时发现：在BIU-87/ADM细胞中，细胞凋亡明显受到抑制^［4］。由于BIU-87/ADM细胞的多药耐药性是应用阿霉素诱导BIU-87细胞形成的^［2］，提示：BIU-87/ADM细胞多药耐药现象的形成过程，可能是BIU-87/ADM细胞凋亡逐步受到抑制的过程。

　　目前，已证实Bcl-2是抑制细胞凋亡的重要基因，是决定肿瘤预后的重要指标，该基因表达增强能显著抑制细胞凋亡。将该基因转入对化疗敏感的细胞，则能产生抗药性^［5］。我们对该基因在BIU-87/ADM细胞中的表达进行了研究。原位杂交及免疫细胞化学结果表明：BIU-87/ADM细胞Bcl-2mRNA表达呈强阳性(＋＋)，BIU-87细胞呈弱阳性(＋)。提示：Bcl-2基因在耐药细胞BIU-87/ADM中的高表达是导致其细胞凋亡受抑制的重要原因。目前，对Bcl-2抑制细胞凋亡有以下假说：①Bcl-2抑制细胞凋亡可能与其直接或间接影响内质网中Ca^2＋有关；②Bcl-2可活化R-ras,同时ras又把raf激酶活化(抑制细胞凋亡)，从而控制细胞信号传递；③Bcl-2能阻断过氧化脂类累积而实现其抑制细胞凋亡的作用，同时Bcl-2过表达可保护细胞免受自由基损伤；④Bcl-2过表达抑制了Bax的促细胞凋亡，导致细胞凋亡受到抑制^［6］。因此，Bcl-2基因可能通过抑制化疗药物诱导的细胞凋亡，参与了人膀胱癌多药耐药现象的产生。

　　我们曾检测BIU-87/ADM及BIU-87细胞中P-糖蛋白的表达，发现BIU-87/ADM细胞中P-糖蛋白高表达，而BIU-87细胞表达阴性，提示：BIU-87/ADM多药耐药的产生与P-糖蛋白高表达有关^［2］。结合本研究，说明Bcl-2蛋白与P-糖蛋白均表达于多药耐药的BIU-87/ADM细胞中。这就产生了一个疑问，Bcl-2蛋白与P-糖蛋白在功能上是否存在着相互影响。有关两者的研究未见报道，有待进一步探讨。

　　作者简介：王祥卫(1969.3)，男，山东省济南市人，硕士，主治医师，讲师，主要从事人膀胱癌多药耐药方面的研究，发表论文4篇。电话：(023)65208809王祥卫(第三军医大学附属新桥医院泌尿外科，重庆　400037)

　　杨唐俊(第三军医大学附属新桥医院泌尿外科，重庆　400037)

　　何斌(第三军医大学附属新桥医院泌尿外科，重庆　400037)

　　金欢胜(第三军医大学附属新桥医院泌尿外科，重庆　400037)

　　曾毅(第三军医大学附属新桥医院泌尿外科，重庆　400037)

　　刘素英(第三军医大学附属新桥医院泌尿外科，重庆　400037)

　　参考文献

　　［1］蔡文琴，王伯.实用免疫细胞化学和核酸分子杂交技术［M］.成都：四川科学技术出版社，1995.406－430.

　　［2］杨唐俊，范立新，杨清浩.人膀胱癌BIU-87细胞系多重抗药性的形成［J］.中华泌尿外科杂志，1996，17(9)：527－529.

　　［3］杨清浩，杨唐俊，范立新.人膀胱癌多重抗药性逆转的实验研究［J］.中华泌尿外科杂志，1997，18(5)：278－279.

　　［4］王祥卫，杨唐俊，何斌，等.阿霉素诱导人膀胱癌多药耐药细胞凋亡的观察［J］.第三军医大学学报，1998，20(2)：128－130.

　　［5］ Miyashite T,Reed J C.Bcl-2 gene transfer increase relative resistance of x49.1 and WEHI 7.2 lymphoid cells to death and DNA fragmentation induced by glucocorticoids and multiple chemotherapeutic drugs［J］.Cancer res,1992,52(19):5407－5411.

　　［6］王雪.细胞凋亡及其调控机制［J］.国外医学：肿瘤学分册，1997，24(增刊)：63－65.