癌基因MDM2过度表达与儿童急性淋巴细胞白血病的发病和预后的关系

　　中华儿科杂志2000年第38卷第7期

蒋莎义　陈力军　高飞　李桂梅　刘廷亮　尹洪臣

　　关键词：MDM2；儿童；急性淋巴细胞白血病；发病；预后

　　MDM2是抑癌基因p53的拮抗基因。p53基因突变发生于人类许多肿瘤，所以被认为与这些肿瘤的发生有关，而在白血病中p53基因突变则少见，却有P53蛋白功能的失活^［1,2］。MDM2过度表达是p53基因突变以外的另一p53基因失活途径。我们用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测了儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）治疗前外周血单个核细胞中MDM2 mRNA表达情况，并分析MDM2过度表达与儿童ALL发病及预后的关系。

　　对象

　　1997年3月～1998年10月收治初发儿童ALL 32例，其中男23例，女9例；年龄1.5～11岁，平均年龄6.6岁。初诊时外周血幼稚细胞在60%以上。每例治疗前抽取外周血5 ml，淋巴细胞提取液提取单个核细胞，置-80℃储存备用。同时收集22例健康儿童外周血，提取单个核细胞作为对照。

　　方法

　　MDM2引物有意义链：5′-TTATTAAAGTCTGTTGGTGCA-3′，反意义链：5′-TGAAGGTTTCTCTTTCCTGAAG-3′;β-actin引物有意义链：5′-AAGGATTCCTATGTGGGC-3′,反意义链：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。TRIZOL试剂提取单个核细胞内总RNA。

　　MDM2、β-actin cDNA的合成：取样本所提的RNA 2 μg，加MDM2(或β-actin) 反意义链引物，AMV逆转录酶等。反应体系总量25 μl，终浓度为dNTP0.5 mmol/L，Mg⁺⁺ 10 mmol/ L，KCl 50 mmol/ L，Tris 50 mmol/ L，42℃水浴1 h，95℃ 5 min灭活AMV酶。

　　PCR扩增MDM2、β-actin cDNA：取上述逆转录产物5 μl，加入MDM2(或β-actin)有意义链和反意链引物、 taq酶等，总反应体系50 μl，终浓度dNTP 200 mmol/ L，Mg⁺⁺200 mmol/ L, KCl 50 mmol/ L，Tris 18 mmol/ L。扩增30个循环，每个循环94℃30 s变性，56℃ 30 s退火，72℃ 60 s延伸。

　　电泳及扫描分析：2% 的琼脂糖凝胶，电泳上述PCR产物2 h，紫外灯下摄像。岛津薄层光密度扫描仪分别测MDM2和β-actin扩增产物电泳带强度的积分值，记录各样本两者积分值之比。χ²检验及四格表确切概率法对结果进行统计学分析。

　　结果

　　根据Buteso-Ramos等^［3］的判断方法，我们将MDM2与β-actin之比＞20%定为过度表达。本组儿童急性淋巴细胞白血病MDM2 mRNA过度表达率为44%（14/32），患儿组MDM2 mRNA表达明显高于对照组（0/22），差异有显著性(P＜0.01)。

　　对接受治疗的25例患儿随访半年以上，根据对化疗的反应及复发情况，将25例患儿进行分组。不良预后组6例：2例于诱导缓解期死于颅内出血，2例用VDLP方案化疗4周，骨髓呈部分缓解，2例诱导缓解后半年内复发；一般预后组19例，持续缓解半年以上。不良预后组MDM2 mRNA过度表达率 (5/6)与一般预后组（5/19）比较，差异有显著性（P=0.0225）。

　　讨论

　　野生型P53蛋白有抑制细胞过度生长，诱导细胞凋亡的作用。MDM2编码蛋白P90能与P53蛋白结合，抑制其功能。目前认为MDM2过度表达是白血病发生的重要环节。高产量的MDM2蛋白抑制了P53蛋白对细胞过度生长的抑制作用，阻止P53蛋白介导的凋亡，在肿瘤的发生中起重要作用。在多数人类肉瘤中，MDM2高表达方式是基因扩增，而在白血病中 mDM2 基因扩增却不常见。我们的研究结果提示，在儿童ALL的发病中是MDM2 mRNA过度表达而非DNA扩增。

　　研究表明，MDM2 mRNA过度表达与儿童ALL的不良预后有关。随着白血病治疗方法的进展，目前70%～75%的儿童ALL已达长期无病生存。但仍有少数患儿对化疗不敏感和易复发，需要早期决定是否使用更有效的治疗手段，如骨髓移植。分子生物学方法在儿童ALL研究中的应用将使我们为临床估计ALL患儿预后、选择有效的治疗方案提供可靠依据。

　　作者单位：蒋莎义(250021　济南,山东省立医院儿科)

　　陈力军(250021　济南, 山东省立医院儿科)

　　高飞(250021　济南, 山东省立医院儿科)

　　李桂梅(250021　济南, 山东省立医院儿科)

　　刘廷亮(250021　济南, 山东省立医院儿科)

　　尹洪臣(250021　济南, 山东省立医院儿科)

　　参考文献

　　1，Seliger B, Papadileris S, vogel U, et al. Analysis of the p53 and MDM2 gene in acute myeloid leukemia. Eur j Haematol, 1996, 57: 230-240.

　　2，Marks DI, Kurz BE, Link MP, et al. High incidence of potential p53 inactivation in poor outcome childhood acute leukemia at diagnosis. Blood, 1996,87: 1155-1161.

　　3，Bueso-Ramos CE, Yang Y, Deleon E，et al. The human MDM2 oncogene is overexpressed in leukemias. Blood, 1993,82:2617-2623.