急性白血病细胞端粒酶活性与预后及多药耐药的关系

临床血液学杂志 2000年第5期第13卷 临床研究

作者：张学军　王福旭　董作仁　郭晓玲　杜行严　郭晓楠

单位：张学军（河北医科大学第二临床学院血液科　石家庄，050000）；王福旭（河北医科大学第二临床学院血液科　石家庄，050000）；董作仁（河北医科大学第二临床学院血液科　石家庄，050000）；郭晓玲（河北医科大学第二临床学院血液科　石家庄，050000）；杜行严（河北医科大学第二临床学院血液科　石家庄，050000）；郭晓楠（河北医科大学第二临床学院血液科　石家庄，050000）

关键词：白血病；端粒酶；多药耐药基因；预后

　　摘要　目的：研究急性白血病(AL)细胞内端粒酶活性与AL预 后、分型及多药耐药(mdr-1)基因表达的相关性。方法：用TRAP法和RT- PCR法分别测定44例AL细胞内端粒酶活性和mdr-1基因的表达。结果：44 例AL患者的白血病细胞端粒酶阳性率为43.2%，mdr-1阳性率为40.9%；端粒酶阳性 者CR率为57.6%，阴性者CR率为88.0%(P＜0.01)；端粒酶表达与mdr-1未 显示出一致性，但端粒酶与mdr-1均阳性者CR率为33.3%，均阴性者CR率则高达86.7 %(P＜0.01)；端粒酶在复发难治者的表达明显高于非复发难治者(P＜0.01 )；端粒酶在急性淋巴细胞白血病中的表达显著高于急性非淋巴细胞白血病(P＜0.0 1)。结论：端粒酶活性阳性的AL患者预后较差；端粒酶活性与mdr-1的 表达无关，提示端粒酶阳性可能是一种影响AL预后的机制之一。

The relationship between telomerase activity and multi drug resistancegene (mdr-1) in acute leukemic cells

ZHANG Xue-jun　WANG Fu-xu　DONG Zuo-ren　GUO Xiao-lin　DU Xing-yan　GUO Xiao-nan

　　（Department of Hematology,the Second Hospital of Hebei Medi cal University,

　　Shijiazhuang,050000）

　　Abstract　Objective:To study the relationship between telomerase activity and multidrug resistance gene(mdr-1) expression in acute le ukemic cells,and their clinical significance.Method:Marrow or peripheral blood samples were analyzed from 44 acute leukemia patients.The t elomerase activity was measured by TRAP method,and mdr-1 gene expression by RT -PCR method.Result:In 44 patients，telomerase positivity was 43.2% (19/44),mdr-1 was 40.9% (18/44).The CR rate was 57.6% and 88.0% in the patients with telomerase positive and negative respectively wa s (P＜0.01).NO relationm,found between telomerase activity and expressio n of mdr-1 gene,but the CR rate was higher in both positive patients than in bo th negative (33.3% and 86.7%,P＜0.01).The positive rate of telom erase was higher in relapsed-refractory group or ALL than in CR group or ANLL.Conclusion:Telomerase was positive in most ALL.No correlat ion was found between telomerase and the expression of mdr-1 gene.It might be a n unfavourable prognostic factor for AL patieots with telomerase positive，espec ially when the telomerase and mdr-1 gene were double positive.

　　Key words　Acute leukemia　Telomerase　Mdr-1 gene　Progno sis

　　近年来研究发现真核细胞内染色体终端的端粒及其复制所需的 端粒酶变化与肿瘤发生有关。端粒酶活性增高与肿瘤细胞增殖加快、分化受抑有关,可使肿 瘤细胞逃脱死亡成为永生细胞^〔1〕。较高的端粒酶活性可能与肿瘤细胞对导致染色 体断裂的化疗药的耐受有关。我们应用端粒重复扩增法(TRAP)及逆转录多聚酶链反应(RT-P CR)分别测定了44例急性白血病(AL)患者白血病细胞端粒酶活性和mdr-1基因的表达，以探 讨端粒酶活性与白血病的疗效、分型及经典多药耐药(mdr-1)基因表达的关系，现将结果报 告如下。

　　1　资料与方法

　　1.1　临床资料

　　本组44例，均符合FAB的诊断标准，男23例，女21例，年龄16～73岁(平均40.6±15.6岁）。初诊40例，复发4例。急性非淋 巴细胞白血病(ANLL)34例，其中M₂ 13例，M₃ 7例，M₄ 1例，M₅ 10例，M₆ 2例， M₇ 1例；急性淋巴细胞白血病(ALL)10例，其中L₁ 3例，L₂ 7例。4例复发患者中M₂ 、M₃、M₅和ALL各1例。

　　1.2　单个核细胞(MNC)制备

　　取骨髓2～3 ml或静脉血5～8 ml，肝素抗凝(100×10³ u/L)，用生理盐水稀释2～3倍。将 其缓慢加至4 ml的Fycoll淋巴细胞分离液中(相对密度1.077)，以2 000 r/min离心16 m in，取界面层MNC，以生理盐水洗涤3次。置于-80℃中保存备用或直接提取RNA。

　　1.3　TRAP检测方法

　　端粒酶试剂盒由北京华美试剂公司提供。取10⁶白血病细胞，捣碎，加裂解液100 μl混匀 ，冰浴30 min，在4℃中以16 000 g离心30 min，取上清液。在反应管中依次加入TRAP-mix 25 μl和Tel-Taq 0.5 μl，提取液1～2 μl,在30℃中保温20 min。加20 μl石蜡油 ，按下列条件进行PCR扩增：变性90℃/30 s，退火52℃/30 s，延伸72℃/30 s，循环30次。 于12%聚丙烯酰胺凝胶1×TBE条件下电泳、银染，出现间隔6 bp梯形条带，≥4条者为阳性。

　　1.4　白血病细胞RNA提取方法

　　采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法^〔2〕提取白血病细胞RNA。

　　1.5　RT-PCR测定方法

　　mdr-1的引物设计、cDNA合成、PCR扩增及mdr-1的测定均按我院血液病研究室的方法 ^〔3〕进行。

　　1.6　治疗方案及疗效判定

　　初治ALL患者采用VCDAP方案（VCR 2 mg×1 d，CTX 800 mg×1 d，DNR 40 mg×1～3 d，Ara -C 200 mg×1～7 d，Pre 1 mg/kg×1～7 d)；初治ANLL患者采用DA或HA方案(DNR 40 mg/m ²×1～3 d，Ara-C 150 mg/m²×1～7 d或Har 4 mg×1～7 d，Ara-C 200 mg×1～7 d )，其中M₃使用ATRA或以ATRA为主联合使用小剂量HA方案化疗，复发难治患者采用AMV方案 (Arc-C 200 mg×1～7 d，MTZ 5 mg×1～3 d，Vp₁₆ 100 mg×4～7 d)。疗效参照我 国标准^〔4〕判定。

　　1.7　统计学处理

　　采用χ²检验。

　　2　结果

　　2.1　端粒酶活性与AL完全缓解(CR)率的关系

　　44例AL患者CR率为72.7%(32/44)，端粒酶阳性率为43.2%(19/44)。端粒酶阳性患者 CR率为57.6%(10/19)，阴性患者CR率为88.0%(22/25)，两者差异有显著性意义(χ ²=6.808，P＜0.01)，。复发的4例患者中，端粒酶阳性者3例，CR 1例；阴 性者1例，CR 1例。

　　2.2　端粒酶活性与mdr-1在不同预后组的表达

　　详见表1。

表1　端粒酶、mdr-1与AL疗效的关系

例(%)

　　由表1可知，非复发难治者28例中，端粒酶阳性7例(25.0%)；复发难治者 16例中，端粒酶阳性12例(75.0%)。两者端粒酶活性明显不同，复发难治者明显高于非 复发难治者(χ²=10.38，P＜0.01)。mdr-1的表达情况与端粒酶一致。

　　2.3　端粒酶活性与mdr-1表达的相关性

　　详见表1。由表1可知，非复发难治者28例中，端粒酶与mdr-1均阳性者4例(14.3%)，均 阴性者13例(46.4%)；复发难治者16例中，端粒酶与mdr-1均阳性者8例(50.0%)， 均阴性者2例(12.5%)，未显示出端粒酶与mdr-1的相关性。但复发难治者双阳性率显著 高于非复发难治者(χ²=6.55，P＜0.05)，双阴性率显著低于非复发难治者( χ²=5.21，P＜0.05)。

　　2.4　端粒酶、mdr-1共同表达与AL预后的关系

　　44例AL患者中，端粒酶与mdr-1同时阴性者15例(34.1%)，其CR率为86.7%(13/15) ；同时阳性者12例(27.3%)，CR率为33.3%(4/12)。两者CR率差异有显著性意义(χ ²=8.132，P＜0.01)。

　　2.5　端粒酶活性与AL亚型的关系

　　详见表2。

表2　端粒酶活性与AL亚型的关系

例(%)

　　^*与ANLL比较χ²=7.15， P＜0.01　　由表2可知，ANLL共34例，端粒酶阳性率为32.4%(11/34)；ALL共10例， 端粒酶阳性率为80.0%(8/10)。ALL端粒酶阳性率显著高于ANLL(χ²=7.15，P ＜0.01)。

　　3　讨论

　　研究表明，端粒酶在恶性肿瘤细胞中的活性上调，以维持肿瘤细胞端粒长度的稳 定性，使细胞获得永生，而在正常组织或良性肿瘤细胞中却失活^〔5〕。Rhyu^{〔6 〕}研究了400多例肿瘤患者临床资料，发现肿瘤细胞端粒酶阳性率高达84.4%，其中淋 巴和造血系统肿瘤23例，端粒酶阳性21例(91.3%)。Norrback等^〔7〕发现端粒酶 活性增高的AL患者预后差，生存率低。关于急性髓性细胞白血病(AML)端粒酶活性的研究显 示，与正常骨髓及骨髓增生异常综合征相比，AML患者端粒酶活性升高，尤以AML复发患者增 高更加显著^{〔5，8，9〕}。本组AL患者端粒酶阳性率为43.2%；端粒酶阳性者缓解 率为57.6%，阴性者缓解率为88.0%(P＜0.01)；AL端粒酶阴性患者的CR率 明显高 于端粒酶阳性患者，复发难治者端粒酶阳性率显著高于非复发难治者。结果提示端粒酶与AL 的预后及复发难治有关。本组AL端粒酶阳性率低于文献报道，可能与检测方法不同有关。

　　端粒酶作为一种本身携带RNA模板，具有DNA修复功能的逆转录酶，可能会使一些致染色体断 裂的化疗药作用减低或失效，与AL耐药机制有关，但国内外尚无此类研究。我们以经典多药 耐药途径作为对照，采用高效、特异的TRAP和RT-PCR方法测定端粒酶活性和mdr-1基因表 达，结果显示端粒酶与mdr-1双阳性AL患者的CR率明显低于双阴性患者(P＜0.01) ，复发难治者的双阳性率明显高于非复发难治者(P＜0.05)。但结果未显示出端粒 酶与mdr-1有相关性，提示端粒酶可能以与经典耐药途经不同的机制影响AL的预后。

　　国外研究未提及ALL与AML端粒酶活性的不同表达。本组研究发现ALL端粒酶阳性率高于ANLL (P＜0.01)，但由于病例数少，难以确定是否与成人ALL疗效差、复发率高有关。关 于肿瘤或永生细胞端粒酶激活的机制尚不清楚，有人报道认为可能与凋亡调控基因bcl-2以 及细胞周期基因cyclin D₁和cyclin E表达水平上调有关^〔10〕。本研究以目前较 明确的经典mdr-1和临床治疗效果作为双重对照，推测端粒酶对AL细胞耐药有影响，研究显 示端粒酶阳性AL患者预后差，但未发现与经典mdr-1表达有相关性，提示影响AL预后的因素 较为复杂。如能同时检测端粒酶活性及mdr-1表达，可更好地预测AL的预后，同时有必要对 ALL的端粒酶作用进行进一步研究。端粒酶抑制剂的研制将为白血病的治疗提供新的思路。

(编辑 王铨)

　　河北省卫生厅科研基金资助课题

　　参考文献

　　1，Haber D A.Telomerase,cancer,and immortality.New Eng l J Med,1995,332:955～956

　　2，Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acidgua nidinium thiocyanate-phenal-chloroform extraton.Anal Biochem,1987,162:156～159

　　3，董作仁，罗建民，徐文新，等.急性白血病患者多药耐药基因mdr-1的表达及临床意义. 中华肿瘤杂志，1997，19：72～75

　　4，张之南主编.血液病诊断及疗效标准.第2版.北京：科学出版社，1998.

　　5，Kim N W,Piatyszek M A,Prowse K R,et al.Specific association of human t elomerase activity with immortal cell and cancer.Science,1994,266:2011～2015

　　6，Rhyu M S.Telomerase,telomerase and immortality.J Natl Cancer Inst,1995 ,87:884～894

　　7，Norrback K F,Roos S.Telomerse and telomerase in normal and malignant h aematopoietic cells.Eur J Cancer.1997,33:774～780

　　8，Shay J W,Werbin H,Wright W E.Telomerse and telomerase in human leukemi as.Leukemia,1996,13:1255～1261

　　9，Counter C M,Gupta J,Harley C B,et al.Telomerase activity in normal leu kocytes and in hematologic malignancies.Blood,1995,85:2315～2320

　　10，Landberg G,Nielsen N H,Tatsumoto N,et al.Telomerase activity i s associate with cell cycle deregulation in human breast cancer.Cancer Res,1997, 57:549～554

(收稿 1999-12-15　修回 2000-04-26)