鼻咽癌中转化生长因子β受体及受体相关蛋白-1的原位表达

中华耳鼻咽喉科杂志 1999年第4期第34卷 头颈部肿瘤

作者：宾亮华　胡成平　湛凤凰　曾朝阳　曹莉　李桂源

单位：410078 长沙 湖南医科大学肿瘤研究所

关键词：鼻咽肿瘤；转化生长因子β；原位杂交；受体；转化生长因子β；免疫组织化学

　　摘要　目的　研究转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF β)、其受体及受体相关蛋白-1（TGF β receptor interacting protein-1,TRIP-1）在鼻咽低分化鳞癌中的表达状况。方法　采用免疫组化技术及原位分子杂交技术，检测同一例标本中癌旁上皮和癌细胞内的3型TGFβ，2种受体的蛋白水平和TRIP-1 mRNA水平，分析其变化规律。结果　TGF β1、TGF β2、TGF β3、TGF βRI、TGFβRII在癌旁上皮表达强于癌组织的百分数分别为65.79%、66.67%、55.26%、48.57%、63.16%。癌旁上皮阳性率都高于癌组织阳性率（P＜0.01），癌细胞TRIP-1mRNA表达平均灰度值19.32±10.70，癌旁上皮平均灰度值为11.96±5.85(P＜0.05)。结论　鼻咽低分化鳞癌中TGFβ信息传递通路中的配体、受体和受体相关蛋白-1表达减弱。

The expression in situ of transforming growth factor βs,their receptors and TGFβ-receptor interacting protein-1 in nasopharygneal carcinoma

BIN Lianghua, HU Chengping,ZHAN Fenghuang,et al.

　　Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078

　　 　　Abstract　Objective　To study the expression of transforming growth factor(TGF)βs, their receptors and TGFβ-receptor interacting protein-1(TRIP-1) in nasopharygneal carcinoma. Methods 　Immunohistochemical technology and in situ hybridization methods were adopted to detect the TRIP-1 mRNA and 3 kinds of TGF β isoforms and 2 kinds of TGFβ receptors protein in the same biopsy specimen.Results The positive expression of TGF β1, TGF β2, TGF β3, TGF βRⅠ and TGFβRⅡ was stronger in the tumor adjacent epithelium than in the tumor itself , which were 65.79%, 66.67%, 55.26%,4 8.57% and 63.16% higher than those in the tumor itself respectively(P＜0.01). The level of TRIP-1mRNA measured in the epithelial cells was also higher than that in the tumor cells (19.32±10.70 versus 11.96±5.85, P＜0.05).Conclusion 　The signal transmission of TGF β family is diminished in the poorly differentiated squamous cell carcinoma of nasopharynx. It may be a factor for the development of nasopharygneal carcinoma.

　　 　　Key Words　Nasopharygneal neoplasms 　　Transforming growth factor beta 　　In situ hybridization Receptors, transforming growth factor beta　　Immunohistochemistry

　　鼻咽癌是我国南方高发恶性肿瘤，最为常见的组织学类型是低分化鳞癌。转化生长因子β(Transforming growth factor β, TGF β)具有广泛的生物学效应：能抑制上皮细胞增殖和促进其分化，促进细胞外基质的形成、血管生成和抑制免疫反应。近年来有关TGF β和其整个信号传递通路与肿瘤关系的研究较为活跃。为探讨它们在鼻咽癌的发病过程中是否有一定的作用，我们应用免疫组化和原位杂交的方法检测了3型TGF β，2型受体（TGF βⅠ、TGF βRⅡ）及Ⅱ型受体相关蛋白(TGF β receptor interacting protein，TRIP-1)^［1］在鼻咽低分化鳞癌活检组织和鼻咽癌细胞株HNE1中的表达状况，探讨了TGFβ与鼻咽癌发病机制的关系。

　　 材料与方法

　　一、材料

　　1.40例鼻咽低分化鳞癌和5例鼻咽部慢性炎症组织取自湖南省肿瘤医院1998年3月～5月门诊活检标本。常规石蜡包埋，HE染色，经病理科确诊。每例低分化鳞癌病例均保证同一例活检组织中均有癌巢和癌旁上皮，癌旁上皮表现为正常和不同程度不典型增生。每个蜡块以4 μm厚连续切片，备染。

　　2.鼻咽癌细胞株HNE1：为本所建株。滴片，吹干，4%多聚甲醛固定，备染。

　　二、方法

　　1.组织染色采用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶(SABC)免疫酶染色法，试剂盒为武汉博士德生物制品公司。所用一抗均为多克隆兔抗，工作浓度均为1∶100。 生产厂家：TGFβ1，TGFβ2，TGFβ3为Maxim Biotech公司(美国)，TGFβRⅠ和TGFβRⅡ为 Santa Cruz Biotechnology 公司(美国)。

　　操作步骤按SABC说明书进行，微波修复，加一抗后4℃过夜，用PBS代替一抗作空白对照。

　　判断标准：用DAB 显色，阳性为棕黄色或棕褐色，胞浆和胞膜着色。

　　根据Shimizu判断^［2］：按染色深浅分：无染色0分，浅色1分，深色2分。按染色范围分：无染色0分，1/3以内1分，1/3～2/3 2分，2/3以上 3分。两项相加0～2分为阴性，3分以上为阳性。

　　2.原位杂交：根据已发表的TRIP-1mRNA序列^［1］设计引物，引物序列Forward：5′ATCCGAT-TATCCAGGGACAT-3′， Reverse:5′-AGACGGAGTTT-TTTGCTCTTGT-3′，扩增片断699 bp，回收反转录聚合酶链反应（reverse transcriptional polymerase chain reaction，RT-PCR）产物作探针。探针标记采用Boehringer Mannheim公司(德国)地高辛DNA标记及检测试剂盒提供的随机引物法进行。取1 μg TRIP-1cDNA标记，产生750 ng的标记探针。石蜡切片脱蜡，梯度酒精水化，0.2 mol/L HCl 10 min，RT。20 μg/ml蛋白酶K消化15 min，37℃，预杂交2 h，37℃，杂交(50%去离子甲酰胺，6Xssc，5xDenhart，10%硫酸葡聚糖，20 ng探针)过夜，37℃。2Xssc，1%SDS，2%TritonX-100 洗片15 min，42℃，2次轻摇；0.2Xssc，1%SDS，2%Triton-X，洗片15min，42℃，2次，轻摇；Buff I(100 mmol/L Tris-cl，150 mmol/L NaCl)洗片，10 min，RT，轻摇；1∶4000 DIG-Ab 2h RT。Buff I，30min，RT，Buff Ⅲ(100 mmol/L Tris-cl，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl₂ )10 min，RT洗片，NBT/BCIP 避光显色30 min～2 h，阳性信号为深蓝色。Buff Ⅳ终止显色，核固红衬染，D.P.X封片。不加探针为空白对照。

　　3.图像分析：原位杂交阳性信号的定量分析采用杜宝东等^［3］方法。应用MIAS-300型图像分析仪（pcvision85 plus，美国)对400倍显微镜每张切片中10个随机视野的癌组织或癌旁粘膜的平均灰度进行测定，之后扣除每例阴性对照的灰度值作为该例的灰度值。灰度值越高表示阳性信号强度越弱。

　　4.统计学分析：两样本率比较采用χ²检验，两样本均数比较采用t和t'检验。

　　结果

　　一、5种一抗的表达状况

　　鼻咽上皮、鼻咽癌细胞、癌旁淋巴细胞、血管内皮细胞、HNE1均表达TGFβ蛋白的3种因子和Ⅰ，Ⅱ型受体（图1～4）。TGFβ1在HNE1细胞株表达很弱（图2），而TGFβ2，TGFβ3及Ⅰ，Ⅱ型受体均有强表达。5例鼻咽慢性炎症患者鼻咽上皮3型TGFβ及其Ⅰ、Ⅱ受体均为强阳性。

图1　TGFβ2在鼻咽癌旁组织中的原位表达，上皮细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞均为强阳性。SABC法 ×400　　图2　TGFβ1在HNE1细胞株中的微弱表达。SABC法 ×200　　图3　TGFβ2在HNE1细胞株中的强表达。SABC法 ×200　　图4　TGFβ3在HNE1细胞株中的强表达。SABC法 ×200

　　二、3型TGFβ、受体及受体相关蛋白-1在鼻咽癌中的表达

　　由于鼻咽癌解剖位置的特殊性，其癌旁组织只能在显微镜下确定，为保证可比性，特选取既有癌巢又有癌旁上皮的同一例活检组织相互对照。结果如表1，2。

表1　同一标本中癌旁上皮与癌组织3型TGFβ及受体表达强弱比较(%)

表2　TGFβ和受体在鼻咽癌中表达差异比较(例数，%)

　　以Trip-1探针测试了28例T RIP-1 mRNA在鼻咽癌中的表达，其平均灰度值癌旁上皮为11.96±5.85（±s，下同），癌细胞为19.32±10.07（ t=2.76，t′0.05=2.09，P＜0.05 ）。

　　3型TGFβ同源异构体蛋白及2型受体有48.57%～66.67%在上皮细胞中表达比癌细胞强，5种因子在癌旁上皮的阳性率均比癌组织高(P＜0.01)，癌组织TRIP-1mRNA表达比癌旁上皮弱。

　　 讨论

　　TGFβ作为细胞生长的负性调控因子，它能抑制多种上皮来源的恶性肿瘤细胞的生长，如头颈部鳞癌、乳腺癌、结肠癌等^［4-7］。恶性肿瘤细胞逃脱TGFβ的负性生长调控作用的机制主要有两个方面^［7］：①TGFβ表达降低或缺失，或潜伏性TGFβ激活障碍，使其抑制上皮细胞生长、促进分化的作用减弱，进而细胞生长失控、癌变；②细胞对TGFβ的反应能力减弱或丧失。受体和受体相关蛋白缺失、基因突变失活、表达降低都可使细胞对TGFβ反应性降低。目前己发现TGFRⅡ在多种肿瘤中有基因突变和微卫星不稳定性^［8］。大多数恶性肿瘤随着肿瘤的进展和分化程度的降低，TGF β的表达降低。但也有例外，如在人和鼠前列腺癌组织中TGF β的表达水平比正常前列腺组织明显增高，生长速度快、分化差的肿瘤细胞株TGF β1mRNA的含量明显高于生长速度慢、分化好的细胞株^［9］。据此认为TGF β的促血管生成作用、免疫抑制作用和影响细胞外基质变化和细胞粘附性的能力，可增强癌细胞的浸润和转移能力，从而促进恶性肿瘤的进展。因此，根据不同的肿瘤细胞类型和肿瘤不同分化程度，TGF β具体发挥的作用有所不同。

　　我们的研究观察到：3种TGF β在鼻咽低分化鳞癌中的表达普遍减弱，有的甚至失去了表达，而癌旁上皮、淋巴细胞、血管内皮细胞还有较强的表达（图1），表明鼻咽低分化鳞癌细胞失去了自分泌TGF β的能力或能力减弱，但其邻近细胞产生TGF β的旁分泌调节机制还基本正常。进一步研究TGF β受体及受体后信号传递通路上的因子TRIP-1在鼻咽癌的表达状况，我们发现Ⅰ、Ⅱ型受体及TRIP-l在癌组织中也分别有蛋白水平和转录水平的表达减弱，说明受体缺乏可能是癌细胞对旁分泌产生的TGF β反应性降低的原因。TRIP-1^［1］是新近克隆的一个TGF β受体相互作用蛋白，该蛋白特异地与TGF βRⅡ结合，引起构型改变而磷酸化。TRIP-1表达下调必定影响TGF β的信号传导，提示TRIP-1转录水平表达异常可能是鼻咽癌逃逸TGF β负调控的机制之一。

　　TGF β2、TGF β3与TGF β1具有同样的生物学效应，比较3种TGF β在鼻咽癌中的表达强弱，我们发现无论是在HNE1细胞株中，还是在鼻咽癌活检组织中；无论在癌旁组织，还是在癌巢中，前两者的表达强度和表达阳性率均明显高于后者（图2～4），表明TGF β1的作用似乎更为关键。实验证明通过基因转染技术提高HL-60细胞自分泌TGF βl的水平后，其恶性表型被明显抑制^［10］。TGF βl是否抑制鼻咽上皮的恶变还需用基因转染技术或基因knock out等技术进一步证实。

　　TGF β、受体及受体后信号传递分子TRIP-1在鼻咽癌中的表达减弱表明：TGF β可能通过自分泌和旁分泌生长调控作用同鼻咽癌的发生和进展有关。但仍有许多问题有待解决，如上述这些因子表达减弱是由于基因结构的改变所致，还是由于基因表达调控的异常所致；它们在鼻咽癌中的调控机理；其表达与临床分期、预后的关系，以及如何利用TGF β作用的关键环节进行鼻咽癌的防治等。

　　本课题由国家863高技术计划资助（No:102-10-01-05）

　　参考文献

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(收稿：1999-01-05　　修回：1999-05-10)