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维甲酸α受体介导全反式维甲酸抑制胃癌细胞生长的作用机理

维甲酸α受体介导全反式维甲酸抑制胃癌细胞生长的作用机理

  中华肿瘤杂志2000年第22卷第3期

  吴乔 陈正明 刘苏 苏文金

  摘 要 目的 探讨维甲酸α受体(RARα)介导全反式维甲酸(ATRA)抑制胃癌细胞生长的作用机理。方法 应用Northern blot分析维甲酸受体在胃癌细胞中的表达水平,通过脂质体转染方法将sense rARα和antisense RARα分别转染到细胞中,通过MTT方法和软琼脂集落形成实验分析ATRA对转染细胞生长和恶性程度的影响,瞬时转染和测定氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性,分析维甲酸应答元件(RARE)的转录活性。结果 ATRA诱导BGC-823细胞RARα表达,但不能诱导MKN-45细胞RARα表达。在转染细胞中,ATRA可以抑制转sense rARα的MKN细胞生长,但不能抑制转antisense RARα的BGC细胞生长。与MKN-45细胞比较,ATRA诱导MKN/RARα细胞βRARE的转录活性较高,但与BGC-823细胞比较,ATRA诱导BGC/aRARα细胞βRARE的转录活性则较低。结论 足够量的RARα对于介导ATRA抑制胃癌细胞生长作用是必需的。

  主题词胃肿瘤;维甲酸;维甲酸α受体;基因转染

  维甲酸(retinoic acid, RA)的作用主要由其受体——维甲酸受体(retinoic acid receptor, RAR)和维甲类X受体(retinoid x receptor, RXR)介导,它们属于类固醇/甲状腺激素受体超家族成员,由3种不同基因α、β和γ编码,由此形成不同的受体亚类[1]。许多证据表明,RAR活性的改变与某些疾病相关。在急性早幼粒细胞白血病中,当染色体发生t(15;17)易位时,导致异常PML-RARα融合受体的产生,并引起非正常的RARα转录[2]。在肺癌中,靠近RARβ基因区的染色体3P短臂经常发生缺失[3]乳腺癌细胞由于不表达RARβ而对RA产生抗性[4]。因此,探讨RAR的功能作用对于阐明RA的抗癌机制具有重要意义。

  材料与方法

  1.胃癌细胞株和药物处理:BGC-823和MKN-45细胞购于上海细胞所细胞库,RPMI-1640培养液培养。10-6 mol/L全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA; Sigma公司)处理细胞。

  2.RNA提取和Northern blot:细胞经ATRA处理24 h后,硫氰酸胍提取和氯化铯超速离心制备总RNA,Northern blot按文献[5]方法。探针RARα、RARβ、RARγ和RXRα由美国加州Burnham研究所张晓坤博士惠赠。以28S和18S定量所用的RNA量。

  3.基因转染和细胞形态观察:克隆有antisense RARα和sense RARα质粒的表达载体(张晓坤博士惠赠)通过脂质体(Gibco bRL)介导方法转染到细胞中,空白载体(pRC/CMV)作为对照,G418筛选细胞,Northern blot确定RARα表达,观察克隆细胞形态。

  4.细胞生长测定:以1 000细胞/孔接种量将细胞接种在96孔板,ATRA处理细胞9 d,MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-6-yl)-6,5-diphenyltetrazolium bromide]方法测定细胞生长率[6]

  5.软琼脂集落形成测定:0.5%琼脂作为底层,在0.3%琼脂中加入细胞,使细胞终浓度为1×105/ml(实验组则同时加入ATRA),混匀后取1 ml铺展在底层琼脂上,凝固后置CO2培养箱中培养,3周后计数集落形成数(直径>80μm集落为阳性)。

  6.DNA瞬时转染和氯霉素乙酰转移酶(CAT)测定:脂质体介导方法将报告基因β rARE-tk-CAT(张晓坤博士惠赠)瞬时转染到细胞中,转染后,细胞经ATRA处理24 h,测定CAT活性[6]

  结果

  1.RARα、RARβ、RARγ和RXRα在胃癌细胞中的表达:Northern blot分析表明,RARα在BGC-823细胞中表达水平较高,在MKN-45细胞中表达水平很低。ATRA诱导后,BGC-823细胞RARα表达水平显著提高,而MKN-45细胞RARα表达水平不变。RARβ在BGC-823细胞表达,在MKN-45细胞不表达;RARγ在两株细胞中均不表达,RXRα在两株细胞中低水平表达。然而,ATRA都不能诱导两株细胞的RARβ、RARγ和RXRα表达(图1)。

  2.转染基因在胃癌细胞中的表达:根据以上结果,将antisense rARα和sense RARα分别转染到BGC-823和MKN-45细胞。Northern blot显示,BGC/aRARα细胞的RARα表达受到抑制,表达水平比BGC-823细胞低,而且ATRA不能诱导其表达,但可以诱导转空白载体细胞BGC/vector的RARα表达(图2A)。相反,MKN/RARα细胞的RARα表达不仅比MKN-45细胞提高,而且ATRA能够诱导其表达,但不能诱导MKN/vector的RARα表达(图2B)。与MKN-45细胞多边形形态比较,MKN/RARα细胞变为细长形,突起消失,圆形细胞增多,而BGC/aRARα细胞形态则与BGC-823细胞类似。

图1 ATRA对胃癌细胞中RARα、RARβ和RXRα转录水平的影响

A:BGC/aRARα细胞;B:MKN/RARα细胞图2 RARα在转染细胞中的表达

  3.ATRA对细胞生长的影响:ATRA可以有效抑制BGC-823细胞生长,但不能有效抑制BGC/aRARα细胞生长,抑制率从61.0%下降到18.4%。相反,ATRA不能抑制MKN-45细胞生长,但可以抑制MKN/RARα细胞生长,抑制率从3.9%上升到31.7%。

  4.ATRA对细胞软琼脂集落形成能力的影响:ATRA可以抑制BGC-823和MKN-45细胞在软琼脂中形成集落的能力,但对BGC-823细胞的抑制率(35.7%)比对MKN-45细胞的抑制率(23.2%)高。相反,转染细胞中ATRA对MKN/RARα细胞形成集落的抑制率(96.1%)大于BGC/aRARα细胞(20.0%)。

  5.ATRA对维甲酸应答元件βRARE转录活性的调节:当报告基因βRARE-tk-CAT瞬时转染后,在BGC-823细胞中,ATRA可以诱导一个较强的CAT活性,诱导倍数(即ATRA诱导的CAT活性/对照组的CAT活性)为3.36,而对MKN-45细胞的诱导倍数为1.3。相反,转染细胞中ATRA不能显著诱导BGC/aRARα细胞的CAT活性,诱导倍数仅为1.8,但对MKN/RARα细胞的诱导倍数则上升为2.75。

  讨论

  RA的作用主要由其受体RARS和RXRS介导。Northern blot分析表明,ATRA可以诱导BGC-823细胞RARα表达,但不能诱导RARβ、RARγ和RXRα表达,提示RARα可能参与ATRA抑制胃癌细胞生长的过程。RA激活的RARα与RXR形成异源二聚体,可以结合到维甲酸应答元件(如βRARE)上,由此调控基因的转录和表达[4]。在急性早幼粒白血病细胞和RA抗性的成神经细胞瘤细胞中,RA可以诱导RARα表达,这种上调作用是由于RA诱导RARα基因启动子上的RARE基元序列(motif)[7]。本研究中,当报告基因βRARE-tk-CAT转染到BGC-823细胞时,ATRA可以显著诱导βRARE活性(即CAT活性),表明BGC-823细胞的RARα具有功能性,在ATRA存在下激活βRARE而刺激细胞生长抑制信号,从而抑制BGC-823细胞生长。但是,当报告基因转染到MKN-45细胞时,ATRA诱导的βRARE活性很低,提示在MKN-45细胞中βRARE转录调节可能发生异常,或者RARα功能丧失,ATRA不能抑制MKN-45细胞生长。

  在成神经细胞瘤中,低水平表达RARα与预后效果差密切相关[8],这是由于RARα受体反映了肿瘤分化的特殊阶段。已知RARα在组织分化过程中具有重要作用,在造血细胞中,RARα表达丰富,但当染色体发生t(15;17)和t(11;17)易位时,RARα受体发生变化,导致造血细胞分化受阻[9]。当将sense rARα基因转染到MKN-45细胞时,ATRA通过对RARα的诱导而抑制细胞生长和降低细胞形成集落的能力。相反,当antisense rARα转染到BGC-823细胞后,ATRA不能诱导RARα表达,细胞由对ATRA敏感转为抗性,形成集落的能力上升。由此证实,RARα在介导ATRA抗胃癌细胞生长和抑制细胞恶性化方面起着关键作用。RARα功能丧失可能导致细胞失去这种调节机制,从而表现出对ATRA抗性。

  另外,当RARα基因转染到MKN-45细胞后,细胞形态由多边形变为细长形,圆形细胞数量增多,这种变化与ATRA存在与否无关,表明细胞形态的改变是由于基因转染引起的。至于圆形细胞的增多是否与细胞凋亡或其他因素有关,尚需进一步研究。

  基金项目:国家自然科学基金资助项目(39880015);国家杰出青年科学基金(B类)资助项目(39825502)

  作者单位:吴乔(361005厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)

  陈正明(361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)

  刘苏(361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)

  苏文金(361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)

  参考文献

  1.Zhang XK, Pfahl m. Regulation of retinoid and thyroid hormone action through homodimeric and heterodimeric receptors. Trends Endocrinol Metab, 1993, 4:156-162.

  2.Grignaini F, Fagioli M, Alcalay M, et al. Acute promyelocytic leukemia from genetics to treatment. Blood, 1994, 83:10-17.

  3.Gebert JF, Moghal N, Frangioni JV, et al. High frequence of retinoic acid receptor βabnormalities in human lung cancer. Oncogene, 1991,6:1856-1863.

  4.Lui Y, Lee MO, Wang HG, et al. Retinoic acid receptor β mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol, 1996, 16:1138-1149.

  5.Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993. 10-11.

  6.吴乔,曾定,苏文金,等.视黄酸受体转录水平的改变与乳腺癌细胞生长的关系.厦门大学学报(自然科学版),1997,36:787-794.

  7.Smarda J, Sugarman J, Glass C, et al. Retinoic acid receptor alpha suppresses transformation by v-myb. Mol Cell Biol, 1995, 15:2474-2492.

  8.Marshall GM, Cheung B, Stacey KP, et al. Regulation of retinoic acid receptor alpha expression in human neuroblastoma cell lines and tumor tissue. anticancer Res, 1993, 13:437-449.

  9.Grihnagni F, Ferruci PF, Testa U, et al. The acute promyelocytic leukemia-specific PML-RAR-alpha fusion protein inhibits differentiation and promotes survival of myeloid precursor cells. Cell, 1993, 74:423-448.


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