鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基诱导SGC-7901胃癌细胞的凋亡

世界华人消化杂志 1999年第9期第7卷 研究快报

作者：范如英　马力

单位：范如英　中国人民解放军北京军区总医院消化内科　北京市　100700；马力　兰州医学院第二附属医院消化内科　甘肃省兰州市　730030

关键词：鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基；胃肿瘤；凋亡

　　中国图书馆分类号　R 735.2

　　Subject headings　podophyllic acid piperidyl hydrazone hitroxide radical; Stomach neoplasms; Apoptosis

　　鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基(GP₁)是从中草药桃儿七(采自青海民和)中提取的有效抗癌成分鬼臼脂毒素的衍生物. 它比鬼臼脂毒素抗癌活性强且毒性低^［1］. GP₁对小鼠移植肿瘤有抑制作用^［2］. 它对小鼠白血病细胞DNA RNA及蛋白质均有抑制作用，其ID₅₀小于VP₁₆^［3］. GP₁对人类胃癌细胞的增长影响如何，它是否具有诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用尚未见报道，现对GP₁作初步探讨.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　GP₁由兰州大学化学系合成提供，用100 mL/ L丙二醇配制成1 g/ L过滤除菌-20℃保存. RPMI1640为美国Gibco公司产品. 小牛血清由兰州医学院血液病研究所提供. MTT试剂为Sigma公司产品，用0.01 mol/ L，pH=7.20 PBS液配成5 g/ L的储存液-20℃保存. 人胃癌细胞SGC-7901引自第四军医大学西京医院. 细胞用含100 mL/ L的小牛血清的RPMI1640完全培养基培养，培养液里另加谷氨酰胺300 mg/ L青霉素100 kU/ L，链霉素100 mg/ L pH 7.20细胞置于37℃，50 mL/ L CO₂培养箱中培养.

　　1.2　方法

　　1.2.1　MTT法实验参考Mosmann^［4］方法　取对数生长期细胞，每孔5×10³细胞接种于96孔培养板中，培养24 h. 实验孔分别加入不同浓度的GP₁. 每孔设3个复孔，培养48 h，每孔加入5 g/ L的MTT液10 μL，继续培养4 h，再加入100 μL SDS溶液终止反应，37℃培养箱中过夜以使甲簪彻底溶解. 在酶联免疫检测仪570 nm波长处测吸光度A. 每个GP₁浓度计算出A均值，按以下公式计算相对抑制率(IR).

　　1.2.2　细胞形态学观察　普通光镜HE及荧光染片：将已消毒的盖玻片分别放入24孔板中，每孔加入对数生长期的细胞培养24 h，各孔分别加入不同浓度的GP₁，每个药物浓度设立3个复孔. 按设定时间取出盖玻片并迅速投入950 mL/ L(4℃)乙醇中，固定20min取出凉干，常规HE及荧光染色. 分别采用普通光镜及荧光显微镜观察. 再将6×10⁵经GP₁作用后的SGC-7901细胞用40 mL/ L戊二醛固定；10 g/ L四氧化锇后固定；梯度酒精脱水；环氧树脂Epon-812包埋；超薄切片观察；醋酸铀和柠檬酸铅双染；JEM100CX透射电镜观察.

　　2　结果

　　2.1　GP₁对SGC-7901细胞生长的抑制作用(图1)　各种药物浓度GP₁作用于SGC-7901细胞48 h用MTT法测试结果表明，GP₁对SGC-7901细胞有明显的抑制作用，且其相对抑制率与药物浓度之间呈显著直线相关(图1)，(相关系数γ=0.992，P＜0.01).

图1　GP₁对SGC-7901细胞生长的抑制作用.

　　2.2　细胞形态学观察　加GP₁后，倒置显微镜下可见到细胞膜皱缩，体积变小，变圆，细胞间失去联系，原来贴壁生长的细胞脱离生长面，呈悬浮状态. 有的细胞有伪足样突起，核仁消失，苔盼兰染色呈拒染性. HE染色后光镜下可见凋亡细胞形态特征性变化，凋亡细胞体积变小，变圆，胞质浓染，胞膜皱缩，染色质致密，有的细胞致密核分布在核膜下，呈月牙状或腰带状，核仁消失. 有的细胞核膜消失，核碎片分布在胞质中，胞膜伸出伪足样突起(芽生). 有的视野可见体积小，胞质成分少，含有或不含致密染色质碎片的小体样结构，即凋亡小体. 高倍镜下随机计数1000个细胞，计算出凋亡指数AI(%)与GP₁浓度呈显著正相关(γ=0.988，P＜0.05). 凋亡指数在作用24 h内随时间的延长而增长，经统计学处理，凋亡指数与作用时间呈显著正相关(γ=0.987，P＜0.05). 口　丫啶噔染色荧光显微镜下凋亡细胞呈致密浓染颗粒或块状荧光，可见芽生现象. 透射显微镜下可见凋亡细胞胞膜表面微绒毛减少或消失，胞体体积缩小，胞质致密度增高，线粒体结构基本清晰，有些内质网空泡变形. 胞核染色质固缩沿核膜分布，有的核膜清晰可见，有的核膜部分消失. 形成凋亡小体(图2).

图2　电镜下SGC-7901细胞凋亡小体形成.

　　3　讨论

　　GP₁是从我国中草药桃儿七中提取的鬼臼脂毒素的衍生物，它能抑制小鼠移植瘤的生长，但它具有诱导人类胃癌细胞凋亡作用尚未见报道. 本实验表明，GP₁能够诱导人类胃癌细胞SGC-7901出现凋亡的特征性形态学变化证实诱导细胞凋亡是GP₁抗肿瘤作用的重要机制. 传统认为肿瘤是由于细胞过度增长导致，对于肿瘤的基础研究主要是肿瘤细胞过度增生的生物学行为，相应临床上也主要围绕如何抑制肿瘤细胞增长来进行治疗. 近年来随着凋亡研究的深入，认识到肿瘤是由于局部组织增生与凋亡失衡而形成，如何诱导肿瘤细胞凋亡为抗癌治疗提供了新途径^［5］，能否诱导细胞凋亡也已成为筛选有效抗癌药物的重要指标. 本实验表明，GP₁能够诱导胃癌细胞凋亡，为GP₁治疗胃癌提供了直接实验依据，为中药桃儿七的开发利用提供了一定的线索.

　　注：作者现系第三军医大学消化内科专业在读博士生

　　通讯作者　范如英

　　4　参考文献

　　1　陈耀祖，张长久，田喧. 具抗癌活性的鬼臼毒自旋标记物衍生物. 中国科学(B)，1986：1205-1211

　　2　王达纬，张培琰，梁重栋. 鬼臼酰乙基肼和鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基(GP₁)对小鼠移植性肿瘤作用的实验观察. 兰州医学院学报，1984：19-20

　　3　王志军，毛小娟，张培琰，梁重栋，田喧. GP₁与VP₁₆对体外白血病L7712细胞DNA与蛋白质代谢的影响. 中国药理学报，1989；10：377-380

　　4　Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survial: application to proliferation and cytotoxity assays. J Immunal Methods, 1983;65:55-63

　　5　朱海青，尹兆红. 与凋亡相关的基因及其在血液系统恶性病中的作用. 国外医学输血与血液学分册， 1995；18：196-198

收稿日期　1999-04-08　收回日期　1999-06-03