福建长乐胃癌分子流行病学研究
世界华人消化杂志 1999年第8期第7卷 研究原著
作者：蔡 琳 俞顺章
单位：蔡 琳 福建医科大学流行病学教研室 福建省福州市 350004; 俞顺章 上海医科大学预防医学研究所 上海市 200032
关键词：胃肿瘤；遗传多态性；细胞色素P450；危险因素；谷胱甘肽转硫酶；病例对照研究
中国图书馆分类号 R735.2
摘 要
目的 研究与致癌物亚硝胺代谢激活有关的细胞色素P4502E1 (CYP2E1)和与致癌物代谢解毒有关的谷胱甘肽转硫酶(GSTM1)基因多态与胃癌易患性，探讨环境-基因在胃癌发病危险中的作用.
方法 应用分子流行病学方法，在胃癌高发区福建省长乐市配比调查101对原发性胃癌病例和按性别、年龄、民族配对的健康对照，PCR-RFLP方法检测CYP2E1和GSTM1基因型，条件Logistic回归模型进行资料分析.
结果 胃癌病例平均年龄58.9岁±11.0岁，对照平均年龄58.6岁±11.1岁，两组年龄性别均衡可比. 胃癌病例CYP2E1的C1/C2或C2/C2基因频率高于对照，但差异无显著性意义〔比值比(OR)=3.10，95%可信限(CI)=0.97-9.91〕. GSTM1基因缺失与胃癌易患性有关(OR=3.27，95%CI=1.14～9.39). 胃癌高发区居民长期食用鱼露(OR=14.74，95%CI=2.96～73.43)、少吃新鲜蔬菜(OR=11.34，95%CI=1.98～64.78)和不良饮食习惯(OR=2.55，95%CI=1.14～5.72)增加了胃癌发生的危险.
结论 CYP2E1和GSTM1基因多态与胃癌易患性有关，遗传代谢易感性与环境饮食因素在胃癌发生过程中具有重要作用.
A molecular epidemiologic study on gastric cancer in Changle, Fujian Province
CAI Lin1 and YU Shun-Zhang2
1Department of Epidemiology, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, Fujian Province, China
2Institute of Preventive Medicine, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China
Subject headings stomach neoplasms; genetic polymorphisms; cytochrome P450; risk factors; glutathione S-transferase; case control studies
Abstract
AIM To study the association between genetic polymorphisms of cytochrome P4502E1 (CYP2E1) and/or glutathione S-transfarase M1 (GSTM1) and susceptibility to gastric cancer, and to investigate the interaction of genetic and environmental factors in etiology of gastric cancer.
METHODS A 1∶1 matched case-control study was conducted in Changle, Fujian Province, a high gastric cancer mortality area. A total of 101 pairs of cases and controls were matched on sex, age and nationality. Genotypes of the CYP2E1 and GSTM1 genes were determined by the polymerase chain reaction. The methods of analysis was conditional logistic regression analysis.
RESULTS Gastric cases were more likely to carry genotypes C1/C2 and C2/C2 than controls, 〔odds ratio (OR)=3.10，95% confidence interval (CI)=0.97-9.91〕. GSTM1 null genotype was a genetic susceptibility factor (OR=3.27，95%CI=1.14-9.39). Fish sauce intake(OR=14.74，95%CI=2.96-73.43)，less consumption of fresh vegetables (OR=11.34，95%CI=1.98-64.78)，and bad eating habits (OR=2.55，95%CI=1.14-5.73)were the risk factors of gastric cancer.
CONCLUSION Genetic polymorphisms in enzymes involved in carcinogen metabolism and environmental risk factors may play an important role in the development of gastric cancer.
0 引言
N-亚硝基化合物与胃癌的关系已引起众多学者的注意［1］，但关于人体代谢亚硝胺的重要同功酶细胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1, CYP2E1)和体内重要的解毒酶系谷胱甘肽转硫酶(glutathione S-transferases, GST)二者与胃癌危险的关系，尤其是代谢酶基因多态和环境暴露因素在胃癌发生中的联合作用，迄今国内外尚未见报道. 应用病例对照分子流行病学方法，我们在胃癌高发区福建省长乐市对遗传代谢易感性与环境致癌因素暴露在胃癌发病危险中的作用进行了研究，为胃癌的病因防治工作提供科学依据.
1 材料和方法
1.1 材料 病例和对照均来自胃癌高发区福建省长乐市. 病例是经市级以上医院确诊的原发性胃癌新病例，按1∶1配比随机选取与病例同性别、同民族、同居住地、年龄差别小于3岁的健康对照. 主要试剂：Taq DNA多聚酶、dNTPs，PCR反应缓冲液和MgCl2，均为Promega公司产品，限制性内切酶PstⅠ和RsaⅠ及相应的缓冲液为MBI Fermentas公司产品，蛋白酶K购自华美生物工程公司.
1.2 方法 ①流行病学调查方法：按统一设计的调查表，逐一对病例和对照进行调查. 内容包括年龄、性别、文化程度等人口学指标、个人生活习惯、饮食情况、疾病健康状况、家族肿瘤史等. 对每一调查对象各采集静脉血5mL. ②外周血基因组DNA提取：采用蛋白酶K消化法，苯酚、氯仿/异戊醇、乙醇抽提DNA，紫外分光光度计定量后备用. ③引物设计和合成：参照文献［2，3］设计CYP2E1引物1: 5-CCAGTCGAGTCTACATTGTCA-3，引物2: 5-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG-3，(410bp)；GSTM1引物1: 5-GCTTCACGTGTTATGGAGGTTC-3，引物2: 5-GAGATGAAGTCCTCCAGATTT-3，(157bp)；β球蛋白基因扩增引物1: 5-CAACTTCATCCACGTTC-ACC-3，引物2: 5-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3，(268bp). 设置β球蛋白基因作为内对照，防止假阴性结果产生. 以上三对引物由加拿大上海Sangong公司合成(PAGE纯化). ④CYP2E1的PCR-RFLP分析：PCR扩增体系反应总体积为50μL，内含100ng～600ng模板DNA，1μmol/L引物、200μmol/L dNTP，1.5mmol/L MgCl2和相应的缓冲液. 用50μL液体石蜡油封盖，95℃预变性5min，冰水浴上加2.5U Taq酶. 热循环参数为94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min. 取PCR扩增产物15μL，用限制性内切酶PstⅠ(10U)或RsaⅠ(5U)37℃消化18h，在22g/L琼脂糖凝胶(含5mg/L溴化乙锭)上，60V电压电泳2h后观察结果. 扩增产物经内切酶消化后分为三个基因型：杂合子(C1/C2)和二个纯合子(C1/C1和C2/C2). ⑤PCR检测GSTM1基因：50μL反应体系含10×buffer 5μL，4×dNTP 3μL，25mmol MgCl2 3μL，引物1μmol/L，模板3μL. 加石蜡油50μL，经95℃变性7min后，加入Taq酶. 按94℃ 30s，60℃ 40s，72℃ 1min，在Perkin Elmer 4800型DNA扩增仪上循环35次后，于72℃延伸10min. 20g/L琼脂糖电泳后，在紫外反射透射分析仪上观察结果. DNA样品经PCR扩增后产生157bp片段的为GSTM1存在，而无相应的扩增产物者为GSTM1基因缺失.
统计学处理 计算基因型频率和等位基因频率，用χ2检验进行显著性检测，用STATA软件进行单因素和多因素条件Logistic回归分析.
2 结果
配比调查101对均为汉族. 其中男性87对，女性14对. 病例组年龄32岁～78岁，平均年龄58.9岁±11.0岁；对照组年龄34岁～79岁，平均年龄58.6岁±11.1岁，两组差异无显著性，t=0.2040，P＞0.05. 病例和对照年龄性别分布均衡可比. 经Hardy-Weiberg遗传平衡吻合度检验，观察值与期望值无显著差异(χ2=1.286，P＞0.20)，胃癌病例和对照的基因型分布符合遗传平衡定律.
2.1 单因素分析 胃癌病例CYP2E1的C1/C2或C2/C2基因频率高于对照，但差异无显著性. 病例组的C2等位基因频率(21.4%)显著高于对照组(12.8%)，χ2=4.91，P＜0.05. 病例组GSTM1基因缺失频率为63.2%，对照组为45.7%，两组差异有统计学显著性(χ2=5.75，P=0.0165). 经条件Logistic回归单因素分析，与胃癌有明显联系的因素是：文化程度、吸烟、饮酒、鱼露摄入、咸鱼、少吃新鲜蔬菜、三餐不定时、暴饮暴食、慢性胃病、GSTM1缺失(表1).
2.2 多因素分析 为控制其他因素可能的混杂作用，进一步进行多因素条件Logistic回归分析，结果表明：鱼露摄入、少吃新鲜蔬菜、三餐不定时、CYP2E1和GSTM1基因多态联合作用，增加了胃癌发生的危险(表2).
表1 胃癌病例单因素条件Logistic回归分析
| 暴露因素 |
量化标准 |
β |
s |
OR |
(95%CI) |
t |
P |
| 文化程度 |
初中以上 (0) |
| |
小学 (1) |
| |
文盲 (2) |
1.5239 |
0.3010 |
4.5900 |
(2.5354～8.3096) |
5.063 |
0.000 |
| 吸烟 |
不吸烟 (0) |
| |
吸烟 (1) |
1.4917 |
0.3689 |
4.4444 |
(2.1473～9.1992) |
4.043 |
0.000 |
| 吸烟总量 |
0 (0) |
| (支) |
1～15000 (1) |
| |
＞15000 (2) |
0.4212 |
0.0989 |
1.5238 |
(1.2539～1.8520) |
4.259 |
0.000 |
| 饮酒 |
不饮 (0) |
| |
饮 (1) |
1.0460 |
0.3224 |
2.8462 |
(1.5072～5.3784) |
3.244 |
0.001 |
| 酒龄(a) |
0 (0) |
| |
1～ (1) |
| |
10～ (2) |
| |
20～ (3) |
0.6741 |
0.1596 |
1.9623 |
(1.4324～2.6884) |
4.223 |
0.000 |
| 新鲜蔬菜 |
经常吃(几乎每天) |
| |
较少吃(3次～5次/wk) |
| |
少吃(≤2次/wk) |
1.0845 |
0.3059 |
2.9580 |
(1.6182～5.4068) |
3.545 |
0.000 |
| 鱼露 |
少吃(＜3次/wk) |
| |
较常吃(≥3次/wk) |
| |
经常吃(每天吃) |
1.7452 |
0.3239 |
5.7271 |
(3.0238～10.8470) |
5.388 |
0.000 |
| 咸鱼 |
少吃(＜3次/mo) |
| |
较常吃(≥3次/mo) |
1.2809 |
0.5055 |
3.6000 |
(1.3252～9.7798) |
2.534 |
0.012 |
| 三餐不定时 |
无 (0) |
| |
偶尔 (1) |
| |
经常 (2) |
0.9742 |
0.2483 |
2.6491 |
(1.6235～4.3226) |
3.923 |
0.000 |
| 暴饮暴食 |
无 (0) |
| |
偶尔 (1) |
| |
经常 (2) |
1.2239 |
0.3006 |
3.4003 |
(1.8797～6.1509) |
4.071 |
0.000 |
| 慢性胃病 |
无 (0) |
| |
有 (1) |
2.1400 |
0.4316 |
8.500 |
(3.6293～19.9076) |
4.959 |
0.000 |
| GSTM1 |
存在 (1) |
| |
缺失 (2) |
0.9008 |
0.3289 |
2.4615 |
(1.2870～4.7095) |
2.739 |
0.007 |
| CYP2E1 |
C1/C1 (1) |
| |
C1/C2orC2/C2 (2) |
0.5789 |
0.3338 |
1.7857 |
(0.9243～3.4500) |
1.737 |
0.084 |
| 因素 |
β |
s |
OR |
95%CI |
t |
P |
| 少吃新鲜蔬菜 |
2.4280 |
0.8833 |
11.3359 |
1.9837～64.7800 |
2.749 |
0.007 |
| 鱼露摄入 |
2.6903 |
0.8139 |
14.7365 |
2.9576～73.4262 |
3.306 |
0.001 |
| 三餐不定时 |
0.9370 |
0.4098 |
2.5522 |
1.1369～ 5.7294 |
2.286 |
0.028 |
| CYP2E1 |
1.1305 |
0.5893 |
3.0971 |
0.9682～ 9.9071 |
1.918 |
0.057 |
| GSTM1 |
1.1847 |
0.5347 |
3.2696 |
1.1385～ 9.3904 |
2.216 |
0.028 |
3 讨论
对于胃癌病因，许多学者认为与环境因素，特别是饮食因素关系密切［4，5］. 本结果显示，经常食用鱼露、咸鱼是胃癌发生的危险因素之一. 鱼露是长乐居民传统的佐餐调味品，实验研究证实鱼露中含有多种亚硝基化合物前体，亚硝化后有直接致突变和致大鼠胃腺癌的作用［6］. 在单因素和多因素分析筛选出的危险因素中，鱼露的OR值最高，表明长期食用鱼露与当地胃癌高发有关. 不良的饮食习惯，如暴饮暴食、三餐不定时、饮食不规律，容易引起慢性胃炎等胃部损伤，从而削弱胃粘膜的保护机制. 经常吃新鲜蔬菜对胃癌有防护作用，这与文献报道一致.
胃癌的发生与环境致癌物有关，然而，即使是在胃癌高发区，也只有小部分人发生胃癌. 提示在相似的暴露条件下，个体易患因素在发病过程中起重要作用. 代谢酶遗传多态性与个体肿瘤易患性的关系是一个日益受到关注的研究领域［7］. 我们首次对代谢酶基因多态与环境暴露在胃癌发生中的作用进行探讨，结果发现CYP2E1和GSTM1基因多态与胃癌易患性有关，个体代谢致癌物的能力直接影响癌症的易患性，调节致癌物代谢的遗传因素是胃癌发生的重要因素，由于大多数环境致癌物是间接致癌物，需经体内代谢活化才能转化成它们的终形式，CYP2E1是活化亚硝胺等小分子质量致癌物的Ⅰ相代谢酶［2］. GSTM1属Ⅱ相代谢酶，它对致癌物多环芳烃环氧化物有很强的解毒能力，其解毒作用在防治肿瘤发生的过程中有重要功用，代谢酶基因等位缺失和酶活性低下，可导致宿主对一些毒物和致癌物的敏感性增高［8］. 因此，Ⅰ相代谢酶和Ⅱ相代谢酶之间的平衡决定了致癌物在体内的剂量，影响了胃癌发生的危险性.
分子流行病学研究结果揭示了遗传代谢易感性与环境致癌因素暴露在胃癌发病危险中的环境-基因联合作用. 当健康个体具有某种患癌风险或暴露在某种可能的致癌因素下时，采取相应的措施可增强机体对抗肿瘤的能力. 故在胃癌高发区更应加大病因防治宣传的普及力度，胃癌高危人群应加强防范环境致癌物的暴露，以降低胃癌的发病率和死亡率.致谢 长乐市卫生局、长乐肿瘤研究所大力支持现场工作，边建超和董传辉博士热情指导实验工作，谨致谢意!
作者简介：蔡琳，女，1958-11-15生，江西省南昌市人，汉族. 1983年上海医科大学本科毕业，1986年湖南医科大学医学硕士，1997年上海医科大学医学博士，副教授，流行病学教研室主任，硕士生导师，主要从事消化道肿瘤流行病学研究，发表论文25篇.
福建省科委基金资助项目，No.K98031
通讯作者 蔡琳，350004，福建省福州市，福建医科大学流行病学教研室.
Supported by the Committee of Science and Technology of Fujian Province, No.K98031
Correspondence to:CAI Lin, Department of Epidemiology, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, Fujian Province, China
Tel. +86·591·3357321
Email. szyu@shmu.edu.cn
作者单位：
4 参考文献
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收稿日期 1998-12-22
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