LHS cDNA的部分克隆及其表达对肝癌细胞行为的影响

北京医科大学学报 2000年第6期第32卷 论著

作者：刘军建　张杰　周柔丽　金城

单位：刘军建　张杰　周柔丽(北京大学基础医学院细胞生物学教研室，北京　100083)；金城(中国科学院微生物研究所)

关键词：克隆；分子；基因表达；癌；肝细胞；药物作用；DNA，环状；肿瘤转移

　　［摘　要］目的：克隆在肝癌组织中低表达的差异显示片段L2的基因cDNA序列，并初步探讨其在肝癌发生、发展过程中的作用。方法：将L2在GenBank中拼接后，分析其序列结构，并构建正义真核表达质粒，转染BEL-7402肝癌细胞后，对转染细胞增殖、粘附、迁移和侵袭等指标进行测定。结果：克隆得到一条1 005 bp的cDNA，其5′端712　bp与人Liprinβ1 cDNA 5′端调控序列和外显子1，2，3序列同源(100%)，而3′端293　bp与Liprinβ1基因内含子4同源(100%)。其间有一个510 bp开放阅读框架，起始密码位置与Liprinβ1基因相同，推断的蛋白产物除C端13个氨基酸残基外，其余均与Liprinβ1同源。此cDNA暂命名为LHS (Liprinβ1-homologous sequence)。LHS cDNA正义转染BEL-7402肝癌细胞系，对于细胞的增殖活性和侵袭能力无明显影响，但可降低肝癌细胞在层粘连蛋白上的粘附和迁移能力。结论：LHS表达下调可能在肝癌的转移过程中起重要作用。

　　［中图分类号］R735.7　　［文献标识码］A

　　［文章编号］1000-1530（2000）06-0526-04

Partial cloning of LHS cDNA and effect of its expression on behavior of hepatocellular carcinoma cells

LIU Jun-Jian,ZHANG Jie,ZHOU Rou-Li

　　(Department of Cell Biology,Peking University School of Basic Medical Sciences,Beijing 100083)

　　JIN Cheng

　　(Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences)

　　ABSTRACT　Objective:To clone cDNA sequence of differential expressed fragment L2 which preferentially down-regulated in hepatocellular carcinoma (HCC),and to preliminarily study its biological function in hepatocarcinogenesis.Methods:Homologous sequences were spliced with L2,and the structure of the spliced gene was analyzed.Sense eukaryotic expression plasmid of the candidate cDNA was constructed，and the proliferation,adhesion,migration and invasion of the transfected BEL-7402 HCC cells were analyzed.Results:A 1 005 bp cDNA was cloned.5′-end 712 bp sequence of the cDNA was homologous (100%) to 5′ non-encoding sequence and exon 1,2,3 sequence of Liprin β1 gene,while 3′-end 293　bp sequence of the cDNA was homologous to intron 4 of Liprin β1 gene.The cDNA was temporarily termed LHS (Liprinβ1-homologous sequence).There was an open reading frame of 510　bp in LHS cDNA sequence,and the position of initiation codon was the same as that of Liprinβ1.Except for the last 13 amino acid residues,LHS was homologous to Liprinβ1 at protein level.BEL-7402 cells transfected with sense sequence of LHS cDNA showed lower ability for adhesion and migrating,while no effect on proliferation and invasion was observed.Conclusion:The down-regulation of LHS expression may play an important role in HCC metastasis.

　　KEY WORDS　Cloning,molecular;Gene expression;Carcinoma,hepatocellular/drug eff;DNA,circular;Neoplasm metastasis

　　肝癌是我国主要的致死肿瘤之一，目前，肝癌临床治疗仍面临一定的问题，因而从分子水平研究肝癌发生、发展和转移的机制，对肝癌的预防、诊断和治疗有极其重要的意义。近年来，已发现了一些基因的结构、表达在肝癌中异常变化^［1，2］，但肝癌发生、发展的复杂机制还远未阐明。进一步寻找肝癌相关基因，分析其功能，仍然是肝癌基础研究中的重要课题。本室以前的研究发现差异显示片段L2 (482　bp)在正常肝、癌旁肝组织中表达较强，而在肝癌组织、胎肝中表达下调^［3］。本研究拟克隆其基因cDNA序列，并初步探讨其表达对肝癌细胞行为的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂

　　TRIZOL试剂、Taq DNA聚合酶和lipofectamine购自Gibco BRL公司；AMV逆转录酶购自Amersham公司；pGEM-T easy试剂盒购自Promega公司； DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ购自Boehringer Mannheim公司。

　　1.2　组织总RNA的提取和细胞培养

　　癌旁肝组织取自邮电总医院，组织离体后立即放入液氮中冷冻，然后置－70 ℃冻存。按一步法^［4］提取总RNA。BEL-7402肝癌细胞系为本室保存，细胞在含10% (体积分数)小牛血清的RPMI-1640培养基，5% (体积分数) CO₂培养箱内37 ℃培养。

　　1.3　L2片段在GenBank中的拼接

　　以BLAST程序在GenBank数据库中检索与L2片段有较高同源性的基因或EST片段，通过拼接使其序列向5′端或3′端延伸。

　　拼接结果用RT—PCR法证实。依据拼接得到的序列—LHS (Liprinβ1-homologous sequence)，设计一对PCR引物，上游引物a (－108～－83)：5′ GGA TCA CTT TGC TGA GTA CAT CCA AG 3′，下游引物c (+519～+544)：5′ CAC AAC ATA GAA ATG CAG CAT CTC AC 3′。以随机引物逆转录癌旁组织总RNA后，进行PCR，反应条件为：94 ℃ 3　min；94 ℃ 1　min，55 ℃ 1　min，72 ℃ 2　min，30个循环；72 ℃ 10　min。克隆PCR产物LHS-ac至pGEM-T easy载体中，命名为pTE-LHS，测序确证其序列。

　　1.4　LHS正义真核表达质粒的构建

　　EcoR Ⅰ酶切pTE-LHS，低熔点胶回收0.65　kb LHS-ac片段，正向插入真核表达质粒pcDNA3.0的EcoR Ⅰ位点，命名为pcD-LHS，用于转染BEL-7402肝癌细胞系。

　　pcDNA3.0质粒0 kb处有1个Hpa Ⅰ位点，其多克隆区有BamH Ⅰ、Eco RⅠ和Xba Ⅰ位点，分别位于0.91、0.94、0.98　kb处，插入片段LHS-ac 0.47　kb处有1个Hpa Ⅰ位点，这些位点可用于鉴定LHS-ac的插入方向。

　　1.5　转染BEL-7402 HCC细胞系

　　用lipofectamine介导法按Gibco BRL试剂操作说明进行转染。以800　mg·L^－1 G418筛选3周后，挑取单克隆细胞培养扩增。pcD-LHS转染的细胞称LHS-7402细胞，对照为BEL-7402细胞和以pcDNA3.0空质粒转染的细胞(mock-transfected,MOCK)。

　　提取LHS-7402细胞和对照细胞的总RNA，以每孔样品20 μg点膜，进行斑点杂交。以地高辛标记LHS-ac片段为探针，进行杂交，以进一步明确筛选的细胞克隆含有目的基因。

　　1.6　转染细胞增殖、粘附、迁移和侵袭的检测

　　1.6.1　细胞增殖的检测　将细胞接种至50 ml培养瓶(10⁴个细胞/瓶)，每24　h取3瓶细胞计数，计算其平均值。连续计数6 d，绘制生长曲线，作为细胞增殖活性指标。实验重复2次。

　　1.6.2　结晶紫法检测细胞粘附　将细胞接种至包被层粘连蛋白的96孔板(2×10⁴个细胞/孔)。培养箱4～6　h后，用Hanks液轻柔漂洗细胞3次以去除未粘附的细胞。粘附细胞经1%(体积分数)甲醛固定、5 g·L^－1结晶紫染色、PBS漂洗3次、10　g·L^－1 SDS 100　μl彻底裂解后，酶标仪上测定波长595 nm吸光度，作为细胞粘附指标。每组设4复孔作为平行样。实验重复4次。

　　1.6.3　Boyden Chamber法检测细胞迁移　在Boyden小室下室中加入趋化因子(3T3细胞培养液上清)200 μl，以聚碳酸酯膜将上下室隔开，在上室中加入细胞悬液(5×10⁵个细胞/毫升) 400 μl，继续培养18　h。取出聚碳酸酯膜，擦去膜上面未侵入膜中的细胞，经甲醇固定，苏木精染色，乙醇逐级脱水，二甲苯透明后，用中性树脂封片。光镜下随机取6个视野(100倍)，计数穿过膜的细胞数，作为细胞粘附指标。实验重复2次。

　　1.6.4　Boyden Chamber法检测细胞侵袭　在Boyden小室下室中加入趋化因子200　μl，以聚碳酸酯膜将上下室隔开，在上室中加入Matrigel (2.4　g·L^－1，50　μl)，置37　℃ 30 min使Matrigel聚合成凝胶，其余操作均同上。1.7　统计方法

　　采用单因素方差分析和q检验分析细胞实验中各组间指标值的差异。P＜0.05为差异有显著性。

　　2　结果

　　2.1　L2片段在GenBank中的拼接

　　在GenBank中检索结果显示482　bp L2片段第1～347　bp与人Liprinβ1 cDNA (Acession No:AF034802)^［5］同源(100%)，而第169～482　bp与EST片段AI478372同源(100%)。

　　拼接以上3条序列后得到一条长1 005 bp的cDNA，其5′端712　bp与Liprinβ1 mRNA 5′调控序列及外显子1、2、3序列同源(100%)，3′端293　bp与Liprinβ1 基因内含子4的5′端序列(见Homo sapiens 12p11-37.2-54.4 BAC RP11-1060J15克隆GenBank报告，Accession No.：AC009509)同源(100%)。其中含有一个510　bp (+1～+510)的开放阅读框架，起始密码位置与Liprinβ1 cDNA相同，推断的蛋白产物除C端13个氨基酸外，其余均与Liprinβ1相同。此cDNA暂命名为LHS (Liprinβ1-homologous sequence) (图1)，GenBank登录号为AJ276680。LHS cDNA 3′端无poly A尾，表明3′端不完整，但3′端调控序列A+T含量较高(67.9%)，符合真核基因结构模式^［6］，并可找到常在人类基因3′非翻译区出现的短序列，如TTTTAA，提示其3′端序列为非翻译序列。

　　引物a和引物c进行RT-PCR，扩增产物测序结果表明与推断序列完全一致，表明拼接序列是正确的，在肝组织中确实存在。

　　2.2　LHS蛋白质产物氨基酸序列的分析

　　用Pcgene和Anthewin软件对LHS蛋白质产物进行分析，结果显示LHS蛋白质产物相对分子质量为19×10³，等电点为4.16，其氨基酸序列无穿膜区，其N端无信号肽序列，而具有较强的亲水性。这表明LHS蛋白质产物可能为一种胞浆蛋白。共97～164位氨基酸可能形成α-螺旋卷曲(α-helical coiled coil)。

　　2.3　LHS cDNA正义真核表达质粒pcD-LHS的构建

　　pcD-LHS质粒经Hpa Ⅰ酶切，得到4.69　kb和1.41　kb两条片段；经EcoR Ⅰ酶切，得到5.45 kb和0.65 kb两条片段；经BamH Ⅰ + Xba Ⅰ酶切，得到5.38 kb 和0.72 kb两条片段，证明插入的LHS-ac的大小和方向均达到预期目的。

图1　拼接的1 005 bp LHS cDNA序列及推断的LHS氨基酸序列

　　Figure 1　The spliced 1 005 bp cDNA sequence

　　and predicted amino acid sequence of LHS

　　2.4　pcD-LHS转染BEL-7402细胞

　　以lipofectamine法转染后，提取转染细胞和对照细胞的总RNA，以LHS-ac片段进行斑点杂交，结果显示，对照BEL-7402细胞和MOCK细胞的LHS表达量较低，而转染细胞的LHS表达量明显提高。表明转染是成功的。

　　2.5　LHS cDNA转染对BEL-7402细胞增殖、粘附、迁移及侵袭的影响

　　图2为LHS-7402细胞及两组对照细胞的生长曲线。从生长曲线可见转染细胞与对照细胞之间的细胞增殖活性无明显变化(P＞0.05,n=12)。

　　结晶紫法检测细胞在层粘连蛋白基质上粘附的结果表明，BEL-7402细胞595 nm处吸光度平均值为1.82±0.36，MOCK细胞为1.77±0.34，LHS-7402细胞则降为1.45±0.34。LHS-7402细胞与两组对照细胞之间的595 nm处吸光度值差异有显著性(P＜0.05,n=16)。

　　用Boyden Chamber法对3种细胞体外迁移能力进行测定。结果表明，作用18 h后，BEL-7402细胞迁移穿过基膜的细胞数为每100倍视野53.75±11.12，MOCK细胞为58.58±12.62，而LHS-7402细胞为30.25±9.93，LHS-7402细胞与两组对照细胞之间的迁移差异有显著性(P＜0.001,n=12)。

　　用Boyden Chamber法对3种细胞体外侵袭人工基膜的能力进行测定。结果表明，作用18　h后，BEL-7402细胞穿过基膜发生侵袭的细胞数为每100倍视野9.80±3.03，MOCK细胞为10.40±2.07，LHS-7402细胞为10.00±2.35。LHS-7402细胞与两组对照细胞之间差异无显著性(P＞0.05,n=12)。

图2　正义转染LHS cDNA对BEL-7402细胞增殖活性的影响

　　Figure 2　The effect of sense transfection of LHS cDNA

　　on proliferation of BEL-7402 cells

　　3　讨论

　　本文将差异显示基因片段L2在GenBank中进行拼接，得到一条1 005 bp的cDNA片段——LHS，LHS由人Liprinβ1基因5′端调控序列、第1～3外显子序列和第四内含子5′端部分序列组成，并通过RT-PCR法证明了此RNA拼接产物确实在肝组织中存在。已有研究证明相同的RNA初级转录本，在不同的组织中由于剪接作用的差异，可产生具有不同编码框的mRNA^［7］。LHS和Liprinβ1的组织分布不同，Liprinβ1基因在人心肌、骨骼肌、脑等组织中高表达，在肝组织中不表达^［5］，而本实验室以前的研究表明LHS在肝组织中表达较强^［3］。LHS和Liprinβ1基因结构相似，而组织分布不同，提示LHS可能为由不同的RNA剪接方式而产生的人Liprinβ1基因的异型分子。

　　LHS在肝癌和胎肝中低表达，而在正常肝和配对非癌肝中高表达^［3］，提示它可能作为一种分化相关基因在肝细胞的异常分化和HCC的发生、发展过程中起重要的阻抑作用。本文用LHS cDNA正义转染BEL-7402肝癌细胞系，转染细胞的增殖活性和侵袭能力无明显变化，但粘附和迁移能力降低，提示LHS表达的上调可能抑制肝癌细胞的运动能力，从而可能与肝癌转移潜能密切相关。

　　LHS与liprinβ1基因结构的相似性提示二者生物学作用的分子机制可能具有某种相关性。Liprinβ类分子可与liprinα类分子通过其C端的LH (liprin homology)区结合，而Liprinα类分子为一种蛋白质酪氨酸磷酸酶——LAR (leukocyte antigen-related protein)的结合蛋白，Liprinβ/Liprinα/LAR复合体可聚集于粘着斑(focal adhesion)，在细胞骨架和细胞外基质之间起中介作用，调节细胞在基质上的粘着及细胞与外环境的信号转导^［5］。本文推测，LHS表达上调可能影响细胞外环境-Liprinβ/Liprinα/LAR复合体-细胞骨架这一信号传递途径，最终通过细胞骨架的改变影响肝癌细胞的粘附和迁移。

　　基金项目：国家自然科学基金(39780038和39800076)及中国科学院院长基金资助课题；

　　参考文献

　　1，Kokura K,Nakadai T,Kishimoto T,et al.Gene expression in hepatomas［J］.J Gastroenterol Hepatol,1998,Suppl:S132-141

　　2，Ng IO.Prognostic significance of pathological and biological factors in hepatocellular carcinoma［J］.J Gastroenterol Hepatol,1998,13:666-670

　　3，刘军建，张　杰，张　宁，等.用荧光差异显示法分离新的肝细胞癌相关基因［J］.北京医科大学学报，2000，32(5)：411-414

　　4，Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction［J］.Anal Biochem,1987,162:156-159

　　5，Serra-Pages C,Medley QG,Tang M,et al.Liprins,a family of LAR transmembrane protein-tyrosine phosphatase-interacting proteins［J］.J Biol Chem,1998,273:15611-15620

　　6，Bird AP.CpG-rich islands and the function of DNA methylation［J］.Nature,1986,321:209-211

　　7，Moore EE,Kuestner RE,Stroop SD,et al.Functionally different isoforms of the human calcitonin receptor result from alternative splicing of the gene transcript［J］.Mol Endocrinol,1995,9:959-968

收稿日期：2000-03-14