TUNEL技术原位检测肝癌细胞凋亡激光共聚焦显微镜观察

　　第四军医大学学报1999年第20卷第2期

李江　王文亮　李玉松　刘斌

　　摘　要　目的：用缺口末端标记技术(TUNEL)对肝硬变、肝细胞肝癌及培养肝癌细胞系的细胞凋亡进行形态学观察.方法：采用德国宝灵曼公司生产的原位末端标记试剂盒对福尔马林固定、石蜡包埋的肝组织和培养肝癌细胞进行TUNEL染色，激光共聚焦显微镜观察肝细胞凋亡的形态特征.结果：TUNEL阳性信号为黄绿色或黄色强荧光，位于胞核，呈环行、小圆形或颗粒状，提示凋亡细胞有典型的新月体状染色质边集、核浓缩以及有大量微核体的形成. 在阿霉素诱导的HCC-9204细胞系还可见凋亡细胞的出泡现象. TUNEL阳性细胞大多HE染色表现为凋亡的细胞.结论：TUNEL技术加激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞是目前原位观察凋亡的理想方法，特别适用于凋亡细胞的早期检测.

　　关键词：细胞凋亡　激光共聚焦显微镜　TUNEL　肝细胞癌　肝硬变

　　0　引言

　　细胞凋亡是细胞死亡中的一种与众不同的死亡形式，发生于各种生理和病理条件下. 目前检测细胞凋亡有形态学和基因组DNA分析的方法. 由于凋亡小体只在凋亡过程的某个时相出现，而且持续时间短，很快即被巨噬细胞或实质细胞吞噬，所以在光镜下，很难区分正在凋亡的细胞. 近些年发展起来的细胞原位凋亡检测技术，包括DNA聚合酶I和Klenow酶催化的原位末端标记技术和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的d-UTP缺口末端标记技术（TUNEL），后者目前被广泛采用. 它可在组织原位同时显示凋亡细胞的形态和分布. 这是其它检测方法所不及的^［1,2］. 我们主要采用德国宝灵曼公司生产的原位末端标记试剂盒对用福尔马林固定、石蜡包埋的肝组织和培养肝癌细胞进行TUNEL染色，用激光共聚焦显微镜观察肝细胞凋亡的形态特征.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　实验细胞　HCC-9204肝癌细胞系由本室建立.

　　1.1.2　石蜡组织　来自西京医院的21(肝硬变6、肝癌15)例活检的肝组织. 病理形态学基本正常，临床诊断与肝脏损害无关的尸检胎肝做为正常对照. 常规100 mL/L福尔马林固定、石蜡包埋，做5 μm连续切片，挂APES胶.

　　1.2　方法

　　1.2.1　培养肝癌细胞凋亡的诱导　参见文献［3］方法，用20 μmol/L阿霉素（意大利爱宝大药房）诱导细胞凋亡.

　　1.2.2　TUNEL染色　采用德国宝灵曼公司生产的原位末端标记试剂盒(Cat. No. 1684795). 其步骤为：①组织片常规脱蜡至水；②微波处理：0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，pH 6.0，至微波中加热92 ℃～98 ℃之间，持续10 min，微波功率为800 W；③封闭内源性DNA酶：DEPC（diethyl-pyrocarbonate）水洗，室温放置30 min；④加用荧光素（FITC）标记的核苷酸和脱氧核苷酸末端转移酶混合液，37 ℃，60 min；⑤在荧光显微镜下观察；⑥阴性对照为省去TUNEL的反应液；阳性对照用DNA酶I（美国Sigma公司产品），分别以50 mg/L，0.1 g/L，0.5 g/L和1.0 g/L预处理组织. 对HCC-9204细胞系的TUNEL染色，则取细胞爬片，经40 mL/L多聚甲醛固定后，置穿透液（含1 g/L Triton X-100的1 g/L枸橼酸钠）中，4 ℃，2 min，其余步骤按④. 以核阳性作为结果判定标准，并结合HE染色，排除HE染色证实为坏死的细胞.

　　1.2.3　HE染色　连续切片进行HE染色. 典型的凋亡肝细胞为细胞体积变小、细胞表面显著的扭曲和“出泡”、细胞核浓缩以及染色体边集呈新月体状.

　　1.2.4　激光共聚焦显微镜观察　所用激光共聚焦显微镜型号为MRC-1024 (BioRad, Watford, UK)固定在含Plan-Ne-ofluar 40x 油浸镜（数值孔径为1.3）的显微镜（Zeiss, Gena, Germany）上，用多线氩离子激光束（25mW）在488 nm激发荧光素(FITC). 这些措施使得在高放大倍数下对微弱的标记物能产生敏锐的荧光信号. 共聚焦系统由Bio-Rad公司提供的软件控制，Compaq奔腾90计算机上运行.

　　2　结果

　　2.1　光镜观查

　　2.1.1　HE染色所见凋亡细胞　肝组织病变有灶性和碎片样坏死，坏死多见于小叶周边区，而单个细胞的死亡分布于肝小叶内. 可见一些带有凋亡形态特征的肝细胞,即细胞核染色质浓缩、边集，有的呈新月体样，胞质明显嗜酸性，有或没有胞浆的浓缩，周围无炎性细胞浸润(Fig 1).

　　2.1.2　阿霉素诱导凋亡细胞　阿霉素诱导的HCC-9204细胞变圆，贴壁能力逐渐消失，细胞核深染，细胞浆浓缩，染色质呈团块状，细胞有“出泡”现象(Fig 2).

　　2.2　激光共聚焦显微镜观察

　　2.2.1　TUNEL染色　结果显示，TUNEL阳性信号为黄绿色或黄色荧光，位于胞核，呈小圆形、环行或颗粒状. 有些阳性细胞出现于肝窦中，大约8 μm左右的小圆形颗粒，其形态难与淋巴细胞和Kupffer细胞区分（如Fig 1）. 在正常胎肝组织中，阳性细胞很少见. 在肝硬变组织中，阳性细胞在小叶内多为散在分布,且于小叶周边靠近汇管区居多. 而在癌组织中，既有散在分布的又有成簇分布的阳性细胞. 在癌旁肝组织中阳性信号较前者少见，分布类似于肝硬变. DNase I作用的阳性对照为阳性，去除TUNEL反应液的阴性对照为阴性.

　　2.2.2　阿霉素诱导的HCC-9204细胞系TUNEL染色　显示同上，另外可见许多典型的“出泡”所形成的细胞周围黄绿色强荧光点(Fig 2).

　　2.2.3　连续切片对照HE染色　TUNEL阳性细胞大多在形态学上表现为凋亡的细胞. 但也有少数阳性细胞无明显的形态学改变，推测这些细胞可能正处于凋亡的早期.

　　3　讨论

　　DNA聚合酶I，Klenow酶催化的原位末端标记技术和TdT酶介导的dUTP缺口末端标记技术是近些年发展起来的细胞凋亡检测技术^［4，5］. 当双链DNA分子的一条链产生缺口时，DNA聚合酶I催化一种模板依赖的核苷酸聚合反应. 从理论上讲，这种反应既可检测凋亡的DNA，又可检测细胞坏死时多种内源性核酸内切酶水解产生的随机片段. 因此在特异性上受到极大限制，目前已很少使用. 而TdT能够对双链DNA断裂的平端进行末端标记，这种反应不依赖模板,它比依赖模板的缺口翻译技术敏感且反应的速度快. 另有研究^［6］发现在凋亡早期，凋亡细胞优先被TUNEL反应所标记，而用DNA聚合酶I缺口翻译技术对坏死细胞同样能够染色且强度无显著差异. 我们的结果提示TUNEL技术是一种直观的、迅速的、原位显示凋亡细胞的方法.

　　由于TdT酶只能把一个标有FITC的脱氧核苷酸加到DNA断裂的3'OH端，因此，在做TUNEL时，凋亡细胞的荧光强度与DNA链的断裂数有显著的相关性，这就为量化分析凋亡过程中DNA链的断裂提供了方法学依据^［7,8］. 我们观察到在肝组织特别是肝硬变组织中有些细胞荧光强度相对较弱，而HE对照染色未见典型的凋亡细胞形态. 由于在凋亡过程中DNA的断裂出现在凋亡形态学改变之前，因此推测这些荧光强度较弱的细胞可能正处于凋亡的早期时相. 比较HE染色法和TUNEL法对凋亡细胞的检测发现，尽管后者可以检出处于各个时相的凋亡细胞，包括那些没有典型凋亡形态学特征的细胞，但是，这两种方法各有其优缺点. TUNEL法的优点是能快速检出单个细胞，但其成本高、形态学较差并可出现假阳性等问题. 而对于HE染色法，需要有经验的病理医师在高倍视野下鉴别，因此不能快速检出凋亡细胞. 另外，还需排除淋巴细胞和炎症细胞的碎片以及细胞的有丝分裂造成的假象. 由于HE染色的成本低和形态学保存完好，所以，在做TUNEL时一定要结合连续切片的HE染色，从而对细胞的凋亡做出正确的判断. 激光共聚焦显微镜的主要优点是改善了深度分辨，把光线限制在标本的很小区域内，降低了光点外其他区域光的散射，检测器前的小孔只允许检测器收集很少部分的从标本发射的荧光，所以能高强度、高清晰度的再现荧光图象的细致结构. 本文就是利用激光共聚焦显微镜的这个特点观察TUNEL阳性细胞，从而显示凋亡细胞核的种种形态学变化特点. 结合相差显微镜的动态观察,我们发现HCC-9204细胞在凋亡的早期，除核仁外，整个细胞核中弥漫分布着断裂的DNA. 这时，激光共聚焦显微镜显示为小圆形黄绿色荧光. 接着，出现DNA新月体样聚集于核膜下，激光共聚焦显微镜表现为环行增强的黄绿色荧光. 凋亡进一步发展，细胞核转变为许多荧光强度高的圆形颗粒状小体. 这与电子显微镜中所见到的电子致密的染色质团相一致. 此外，细胞还出现“出泡”现象，共聚焦显微镜显示为细胞旁聚集的黄绿色荧光小体，而核膜完整. 在激光共聚焦显微镜下，用TUNEL染色可清晰地观察到处于各个时期的凋亡细胞. 当然，激光共聚焦显微镜的作用还远非如此，对凋亡细胞的二维或三维重建有利于深入认识凋亡细胞的空间结构，另外也可对凋亡细胞内钙离子浓度的变化进行分析^［9，10］.

　　综上所述，TUNEL技术作为一种比较成熟的凋亡细胞染色方法已被广泛采用. 在激光共聚焦显微镜下，TUNEL染色原位观察凋亡细胞是目前较理想的方法.

图1　肝细胞肝癌组织中典型凋亡细胞的形态学特征

　　fig 1　Characteristic morphology of apoptosis in the tissue of hepatocellular carcinoma

　　a. HE staining　×400; b. TUNEL staining, observed under laser confocal microscope. Bar represents 10 μm.

图2　阿霉素诱导HCC-9204细胞凋亡的形态学特征

　　Fig 2　Morphology of apoptosis as observed in HCC-9204 cell line exposed to adriamycin(20 μmol/L)

　　c. HE staining　×200; d. TUNEL staining, observed under laser confocal microscope. Bar represents 10 μm.

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目　No.39470771

　　作者简介：李　江，男，1972-05-28生，天津市人，汉族.第四军医大学1997年级博士生，已发表论文6篇.导师王文亮.电话：（029）3287001，（029）-3374039.E-mail a5216161@public.xa.sn.cn

　　作者单位：第四军医大学基础部病理学教研室　陕西　西安　710033

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