血管内皮生长因子及其受体在肝癌细胞株中的表达及意义

　　第四军医大学学报2000年第21卷第6期

刘承利　窦科峰　李冰

　　摘　要：目的　 探讨血管内皮生长因子（VEGF）及其受体在肝癌细胞系中的表达及意义.方法　采用免疫组织化学及免疫荧光方法检测了两株肝癌细胞株及一株正常肝细胞株中VEGF及其受体的表达，并用Western blot法对VEGF表达半定量.结果　 VEGF在肝癌细胞株SMMC 7721及HHCC中以及正常肝细胞株QZG中均有表达，灰度值分别为218±4，215±4和228±6，SMMC 7721及HHCC中VEGF表达强于QZG，两者之间有显著统计学差异(P＜0.05)；VEGF受体KDR在HHCC中呈弱阳性表达，在7721及QZG中无表达，受体flt-1在三株细胞中均无表达.结论　VEGF及其受体在肝癌细胞中的表达与肝细胞癌的发生发展有关.

　　关键词：血管内皮生长因子；受体；肝细胞癌；细胞株

　　0　引言

　　血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是最重要的肿瘤血管生成调控因子之一，在许多肿瘤中均呈强表达，其受体主要分布在肿瘤区新生血管内皮表面^［1］. VEGF通过旁分泌机制起作用. 此外在某些肿瘤中亦发现有VEGF受体的表达，预示VEGF尚存在自分泌调节途径^［2］. 肝细胞癌作为多血管性肿瘤，已证实其VEGF呈高表达^［3］，但VEGF受体表达情况如何，尚未见系统研究. 我们探讨了VEGF及其受体在体外培养的肝癌细胞系及正常肝细胞系中的表达情况，以进一步认识VEGF在肝细胞癌发生发展中的作用及其机制.

　　1　材料和方法

　　1．1　材料　肝癌细胞株SMMC 7721，HHCC及正常肝细胞株QZG由本校病理学教研室863课题组保存并提供，培养于含100 mL·L^-1灭活小牛血清的RPMI 1640培养液中，取对数生长期细胞进行实验. 所有实验均重复3次. VEGF兔抗人多抗及APA免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程公司，flt-1兔抗人多抗为oncogene research产品，KDR兔抗人多抗购于北京中山生物制品公司，羊抗兔FITC-IgG购于华美公司.

　　1．2　方法

　　1．2．1　APA免疫组化法　培养细胞爬片，950 mL·L^-1乙醇固定30 min，按二合一APA免疫组化试剂盒说明方法进行免疫组化染色. 兔抗人VEGF多抗用PBS按1∶100稀释，同时设PBS代替一抗为对照. 阳性标准为：胞质内棕黄色颗粒. 结果以日本Olympus图像分析仪进行图像分析.

　　1．2．2　免疫荧光法　培养细胞悬液制备细胞涂片，950 mL·L^-1乙醇固定30 min，兔抗人flt-1,KDR多抗用PBS按1∶100稀释，二抗羊抗兔FITC-IgG按1：10稀释，抗体孵育条件为37℃湿盒内30 min，同时设PBS代替一抗为对照，500 mL·L^-1缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察并摄片，阳性标准为：胞膜黄绿色荧光.

　　1．2．3　Western blot法　按《分子克隆》方法：取5×10⁶个细胞，经单去污剂裂解液处理，紫外分光光度计定量后，每管15 μL分装置-70℃冰箱保存备用. 取样品每管加入等量2×SDS凝胶加样缓冲液，沸水浴10 min，100 g·L^-1SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，90 V,4℃电转移2 h，依次孵育于兔抗人VEGF多抗（1∶500）、羊抗兔IgG-HRP（1∶500），DAB显色，岛津CS-9000薄层扫描仪定量.

　　1．2．4　图像分析　免疫组化标本经日本Olympus图像分析仪进行图像分析，每个标本随机选取10个高倍视野（400×）测定其灰度，计算±s，作为该标本的VEGF平均表达强度. 灰度值＜250为阳性.

　　统计分析: t检验，P＜0.05为相差显著.

　　2　结果

　　2．1　免疫组化结果　肝癌细胞株SMMC 7721，HHCC及正常肝细胞株QZG均表达VEGF，阳性物质分布于胞质中，呈棕黄色颗粒状（Fig 1），细胞阳性率为100%，其灰度值分别为218±4，215±4和228±6. SMMC 7721，HHCC与正常肝细胞株QZG相比差异显著(P＜0.05).

　　2．2　免疫荧光结果　 KDR在HHCC中呈弱阳性表达，阳性物质分布于胞膜表面，呈黄绿色荧光（Fig 2），阳性率为100%，在SMMC 7721，QZG中未见阳性表达. Flt-1在三者中均未见阳性表达.

图 1　血管内皮生长因子(VEGF)在肝癌细胞株及正常肝细胞株中的表达

　　Fig 1　VEGF expression in HCC cell lines and normal hepatocyte cell line　PAP　×400

　　A：HHCC；B：SMMC7721；C：QZG

图 2　血管内皮生长因子受体(KDR)在肝癌细胞株HHCC中的表达

　　Fig 2　KDR expression in HHCC　Immunofluotescent method　×400

图 3　VEGF在肝癌细胞株及正常肝细胞株中的表达

　　Fig 3　VEGF expression in HCC cell lines and normal hepatocyte cell line　Western blot

　　A：HHCC；B：SMMC7721；C：QZG

　　2．3　Western blot结果　 在相对分子质量23 ku附近，SMMC7721,HHCC,QZG均呈现阳性条带（Fig 3），岛津CS-9000薄层扫描结果显示，蛋白印迹吸光度值A分别为2314，2760和1734. SMMC7721，HHCC均高于QZG.

　　3　讨论

　　目前对于VEGF在肿瘤细胞中的来源、作用及作用方式认识不一. 大多数研究表明，VEGF主要来源于肿瘤细胞，如胃癌、肾癌、膀胱癌、乳癌、黑色素瘤、胶质瘤、及肝癌等VEGF 均呈高表达^［4］. 已证实能够高表达VEGF的人类肿瘤超过百种. VEGF作为内皮细胞特异性有丝分裂原具有促进血管生成和增加血管通透性的功能，它能够刺激血管内皮细胞增殖和毛细血管袢的形成，并向瘤内伸长以及通过引起血管对血浆蛋白的高度通透性而诱导间质的产生. 血管新生为肿瘤的生长提供了血供，间质的产生也为肿瘤生长及血管新生提供了适宜的局部环境. VEGF作用于内皮细胞是通过其受体实现的，早在数年前Dvorak等^［5］用免疫组化法证明除肿瘤细胞表达VEGF外，肿瘤区的血管内皮细胞中VEGF亦为阳性，而VEGF mRNA为阴性，所以他认为血管内皮细胞并不表达VEGF，而是VEGF与血管内皮细胞表面的VEGF受体结合后而呈阳性. 目前发现的VEGF受体主要有两种，即flt-1（fms样酪氨酸激酶）和flk-1/KDR（胎肝激酶-1），它们具有受体酪氨酸激酶活性，如KDR与VEGF结合后，进行自动磷酸化，能够介导VEGF依赖性Ca²⁺外流^［6］. VEGF受体的分布决定了VEGF作用的方式和特点，通常认为VEGF受体的表达局限于内皮细胞，而Boocock等^［2］的研究发现在卵巢癌VEGFR不仅在血管内皮细胞中表达，而且部分肿瘤细胞亦有受体分布，从而认为VEGF除以旁分泌途径来促进肿瘤细胞生长以外，可能还存在自分泌途径. Soker等^［7］也报道在肿瘤细胞表面存在VEGF165的受体，并可能与肿瘤细胞的生长有关. 此外在黑色素瘤^［8］、平滑肌肉瘤^［9］等的检测亦证实这一点.

　　肝细胞癌作为多血管性肿瘤其生长及转移均与血管新生有关，已证实其VEGF呈高表达. 我们以前的研究发现肝癌细胞中不仅高表达VEGF，而且部分肿瘤细胞中还有VEGFR的分布，从而推测VEGF可能以自分泌、旁分泌两种途径来促进肿瘤细胞的生长. 为了进一步证实VEGF在肝细胞癌中的作用，我们选用两种肝癌细胞系及一种正常肝细胞系进行VEGF及VEGFR检测. 结果显示：在肝癌细胞系7721，HHCC中VEGF 均呈高水平表达，其表达强度高于正常肝细胞QZG，经t检验结果具有显著统计学差异（P＜0.05）. 此结果与国内外的研究是一致的，再一次说明VEGF在肝细胞癌的发生发展中具有重要作用. 此外，肝癌细胞系HHCC尚表达一定强度的KDR. 虽然VEGF受体在肿瘤细胞中的表达尚存在很大争议，但是在部分卵巢癌细胞系及黑素瘤细胞系中确实有KDR的分布，Masood等^［10］报道在Kaposi肉瘤细胞中不仅检测到高水平的flt-1和KDR，而且抑制VEGF的表达后能显著抑制瘤细胞的生长，说明VEGF尚通过自分泌机制起作用. 本研究首次在肝癌细胞系中检测到KDR的存在，说明VEGF不仅通过调节血管新生促进肿瘤生长，还可能直接作用于肿瘤细胞. 此外，永生化的正常肝细胞系QZG中VEGF表达量虽低于7721，HHCC，但亦显示较强表达（灰度值为228±6）. 此结果是否预示VEGF可能与细胞凋亡有关尚须进一步研究. 本结果说明：①VEGF在肝癌细胞中呈高表达，其在肝细胞癌的发生发展过程中扮演重要角色. ②肝癌细胞株亦能表达VEGFR，因此，同时针对VEGF及其受体的抗血管生成治疗肿瘤或许更为有效. ③永生化的正常肝细胞株亦可表达较高水平的VEGF，其作用如何，尚待进一步研究.

　　作者简介：刘承利（1971-），男（汉族），安徽省霍邱县人. 硕士生（导师窦科峰），医师. Tel.(029)3375259　Email.gdwk@fmmu.edu.cn

　　刘承利（第四军医大学西京医院肝胆外科，陕西 西安710033）

　　窦科峰（第四军医大学西京医院肝胆外科，陕西 西安710033）

　　李冰（空军东湖疗养院疗养科，湖北 武汉 430072）

　　参考文献：

　　［1］ Guidi AJ, Abu Jawdeh G, Tognazzi K et al. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) and its receptors in endometrial carcinoma［J］. Cancer, 1996;78(3): 454-460.

　　［2］ Boocock CA, Charnock Jones DS, Sharkey AM et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors flat and KDR in ovarian carcinoma［J］. J Natl Cancer Inst,1995; 87(7): 506-516.

　　［3］ Chow NH, Hsu PI, Lin XZ et al. Expression of vascular endothelial growth factor in normal liver and hepatocellular carcinoma:An immunohistochemical study［J］. Hum Pathol,1997; 28(6): 698-703.

　　［4］ Ferrara N. The role of vascular endothelial growth factor in pathological angiogenesis［J］. Breast Cancer Res Treat,1995; 36(2): 127-137.

　　［5］ Dvorak HF, Sioussat TM,Brown LF et al. Distribution of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) in tumors:Concentration in tumor blood vessels［J］. J Exp Med,1991; 174(5): 1275-1278.

　　［6］ Fan TP.Angiosuppressive therapy for cancer［J］. Trends Pharmacol Sci,1994;15(2):33-36.

　　［7］ Soker S, Fidder H, Neufeld G et al. Characterization of novel vascular endothelial growth factor (VEGF) receptors on tumor cells that bind VEGF165 via its exon 7-encoded domain［J］. J Biol Chem,1996; 271(10): 5761-5767.

　　［8］ Gitay Goren H,Halaban R, Neufeld G. Human melanoma cells but not normal melanocytes express vascular endothelial growth factor receptors［J］. Biochem Biophys Res Commun,1993;190(3):702-708.

　　［9］ 李沛雨, 袁　玫, 蒋彦永. 几种生长因子及血管内皮生长因子受体在胃肠道平滑肌肉瘤中的表达［J］. 中华病理学杂志,1998;27（6）：447.

　　［10］ Masood R,Cai J,Zheng T et al.Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor is an autocrine growth factor for AIDS-Kaposi sarcoma［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1997; 94(3): 979-984.