McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡与CPP32基因表达的关系

中国免疫学杂志 2000年第8期第16卷 肿瘤免疫学

作者：潘德顺　陈伟强　王迪浔

单位：潘德顺（广东药学院病理生理教研室，广州 510224）；陈伟强（广东药学院病理生理教研室，广州 510224）；王迪浔（同济医科大学病理生理教研室，武汉 430030）

　　中国图书分类号　R735

　　1994年Teresa等克隆出人的CPP32(caspase-3)cDNA,并证实CPP32基因与细胞凋亡有密切关系^［1］；CD28和CD80 McAb共刺激PBLs作用于培养的肝癌细胞能引起肝癌细胞凋亡^［2］；为了探讨其机制，本文进行了相关的研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　淋巴细胞的分离培养　参见文献［2］。

　　1.2　肝癌细胞(BEL-7402)培养　参见文献［2］。

　　1.3　单克隆抗体(McAb)来源　CD28(T细胞亚群干粉)、CD80(B细胞亚群干粉)均购自法国Immunotech公司。

　　1.4　细胞总的DNA提取及琼脂糖凝胶电泳　肿瘤细胞总的DNA提取按标准程序进行^［3］，DNA样品用紫外分光光度计定量，5%琼脂糖凝胶电泳。

　　1.5　逆转录PCR　一步法提取RNA，紫外分光光度计定量及电泳确定RNA质量，取10 μg总的RNA按逆转录试剂盒说明进行逆转录，CPP32基因引物参照文献［1］合成，上游引物TGTGACTTCTGGAGTCACC

　　TAAGTT与CPP32基因cDNA第233～257 bp相对应；下游引物AGAAACATCTCGCATCACTTCCACA与cDNA第511～536 bp相对应；经PCR扩增的片段是253 bp。

　　1.6　特异产物的检测　10 μl PCR反应产物加上2 μl上样液，以1×TAE电泳缓冲液在2%琼脂糖凝胶上，100 v恒压电泳30 min，在紫外灯下照像，以条带大小及深浅判断CPP32 mRNA的水平，并经图像分析处理，以平均光密度条带面积表示总的光密度(OD)来代表mRNA量。

　　1.7　统计学处理　数据均以±s表示，各组间结果进行t检验。

　　2　结果

　　2.1　肿瘤细胞DNA琼脂糖凝胶电泳结果　肿瘤细胞组和单纯淋巴细胞处理组的肝癌细胞未见凋亡现象发生，而经CD28+CD80共刺激的淋巴细胞则能明显诱导肝癌细胞凋亡(见图1)。

图1　肝癌细胞DNA琼脂糖凝胶电泳结果

　　Fig.1　The electrophoretic results of the DNA of hepatocellular carcinoma cell line

　　Note:A:BEL-7402;B:BEL-7402 treated by PBLs;C:BEL-7402 treated PBLs costimulated with McAb(CD80+CD28)

　　2.2　肝癌细胞在不同情况下CPP32 mRNA水平　CPP32扩增条带经图像分析处理，其肝癌细胞组(n=7)OD值为1.32±0.22，单纯淋巴细胞处理组(n=8)OD值为1.28±0.25，二者之间没有显著差异性(P＞0.05)；经CD28+CD80处理组(n=8)OD值为2.35±0.32，明显高于肝癌细胞组和单纯淋巴细胞处理组(P＜0.05)。结果说明：经CD28+CD80处理的淋巴细胞能明显诱导肝癌细胞CPP32的高表达。

　　3　讨论

　　T淋巴细胞在肿瘤免疫中起着关键作用，在一些试验系统中起主要作用的是CD8⁺细胞，但有些试验证实CD4⁺细胞也是主要的效应细胞；T淋巴细胞活化的双信号学说认为T细胞抗原受体(TCR)和MHC抗原肽结合提供第一信号，第二信号则是共刺激受体与配体相互结合介导；CD28与TCR激活相似的传导途径，但只有在共刺激后，TCR途径传导才能达到最佳激活，就是说CD28维持了TCR诱导的第二信使作用；大量的实验证实CD80与T细胞上CD28分子相结合后稳定IL-2 mRNA，促进IL-2产生以及防止特异抗原诱导的T细胞耐受^［4，5］。实验证实CD28+CD80共刺激T淋巴细胞能诱导明显肝癌细胞凋亡^［2］，故本实验选用CD28+CD80共刺激T淋巴细胞诱导肝癌细胞凋亡。人类CPP32基因和Ced-3基因(线虫细胞凋亡基因)高度同源，并且具有相同的功能，有实验证实，CPP32基因“剔出”，小鼠神经细胞的凋亡大幅度下降，且多种因素诱导的细胞凋亡与CPP32相关，CPP32酶主要通过裂解DNA修复酶(PARP)、DNA依赖蛋白激酶、蛋白磷酸激酶2A等导致细胞凋亡^［6，7］；本实验结果显示：CD28+CD80共刺激T淋巴细胞能同时诱导肝癌细胞的凋亡和CPP32基因高表达，这表明CD28+CD80激活T淋巴细胞诱导肝癌细胞凋亡的机制与CPP32基因高表达相关，激活的T细胞通过某种途径诱导肝癌细胞CPP32基因表达增加，从而导致其凋亡。

　　作者简介：潘德顺，男，36岁，医学博士，主要从事肿瘤免疫研究

　　4　参考文献

　　［1］Teresa F A,Gerald L，Emad S A.CPP32,novel human apoptotic protin with homology to caenorhaditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalin interleukin-1β-converting enzyme.J Biol Chem,1994;269:3076

　　［2］黄树林，罗利琼，肖凤兰 et al.McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡.中国免疫学杂志，1998；14(2)：154

　　［3］Morgenbesser S D,Will Bo,Jacks et al.P53-dependent apoptosis produced by RB-deficiency.Nature,1994;371:21

　　［4］Laszlo C R,Yufang S,Homayoun V et al.CD28 costimulation inhibits TCR-induced apoptosis during a primary T cell response.J Immunol,1996;156:1788

　　［5］Harding F A,Allison J P.CD28-B7 interations allow the induction of CD8+cytotoxic T lymphocytes in the absence of exogenous help.J Exp Med,1993;177:179

　　［6］Kuida K,Zhen T S,Na S et al.Decreased apoptosis in the brain and brain and premature lethality in CPP32-deficient mice.Nature,1996;384:368

　　［7］Casciola R,Livia A,Anhalt G J et al.DNA-dependent protein kinase is one a subset of autoantigents specifically cleaved early during apoptosis.J Exp Med,1995;182:1625

［收稿：1999-06-05　修回：1999-11-12］