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抗人肝癌免疫毫微粒的制备及体外免疫学性质的鉴定

肝癌免疫毫微粒的制备及体外免疫学性质的鉴定

中国免疫学杂志 2000年第5期第16卷 免疫学技术与方法

作者:刘晓波 蔡美英

单位:刘晓波(华西医科大学免疫学教研室,成都 610041);蔡美英(华西医科大学免疫学教研室,成都 610041)

关键词:毫微粒;单克隆抗体;肝癌;米托蒽醌

  摘 要 目的:构建肝癌特异的免疫毫微粒,探讨免疫毫微粒体外对 靶细胞的特异性结合特性及杀伤活性。方法:采用异型双功能交联剂SP DP将肝癌单抗HAb18与载米托蒽醌的白蛋白毫微粒化学偶联,构建肝癌特异的免疫毫微 粒;采用玻片凝集试验,免疫荧光法及荧光染色阻断法,花环形成实验及花环形成阻断实 验 ,扫描电镜, 3H-TdR掺入试验证明抗体与载药毫微粒偶联及免疫毫微粒能特异性结 合并 杀伤靶细胞SMMC-7721肝癌株。结果:HAb18抗体已偶联到载药毫微 粒上;免疫毫微粒能良好地与靶细胞特异性结合,对靶细胞具有剂量依赖性、选择性杀伤作 用。结论:SPDP偶联方法能用于构建免疫毫微粒;肝癌特异免疫毫微 粒体外能特异性结合并杀伤肝癌细胞株。

  中国图书分类号 R392.2 R730.61

Preparation and immunological characterization of mitoxantrone-loaded immuno-nanoparticles against human hepatoma

LIU Xiao-Bo CAI Mei-Ying

  (Department of Immunology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)

  Abstract Objective:To construct human hepatoma-specific immunonanoparticles and observe in vitro binding and killing of target cells by the immunonanoparticles.Methods:Hetero bifunctional cro sslinker SPDP was used to couple covalently McAb HAb18(anti-human hepatoma) wit h mitoxantrone-loaded bovine serum albumin nanoparticles(DHAQ-BSA-NP). A lot o f in vitro experiments,such as slide agglutination test,immunofluorescent assay, i mmunofluorescent blocking test,rosset formation test,rosset formation blocking t est and scanning electron microscopy etc,were used to confirm coupling of antibo dies to nanoparticles and specific binding of immunonanoparticles with target c e lls.3 H-TdR incorporation test was used to assay cytotoxicity of immunonano par ticles to target cells.Results:McAb HAb18 was coupled to D HAQ-BSA-NP. The immunonanoparticles could bind specifically to human hepatoma SMMC-7721 cells and exert selective killing effects on the target cells with do se-dependence.Conclusion:Conjugation technique via SPDP i s a good method for constructing immunonanoparticles. Human hepatoma-specific- immunonano particles have capacity of in vitro selective coating and killing human hepatoma cell line.

  Key words Nanoparticles Monoclonal antibody Mitoxantrone  Human hepatoma

  将化疗药物吸附、包裹或夹嵌在白蛋白等生物可降解材料中制成毫微粒(N anop articles,NP),应用于肿瘤治疗是目前药剂学中研究热点[1,2]。毫微粒具有载 药 量大、缓释药物、药物无需化学偶联而以游离形式被包封等多重优点,此外它具有靶向给药 特性,即能将药物选择性浓集于病变部位,而不分布或少分布在其它正常部位[1,3 ]。然而毫微粒的这种靶向给药是器官被动靶向,无主动靶向结合癌细胞作用,因此毫微 粒释药杀伤癌细胞同时,不可避免对正常组织造成损伤[4]。将肿瘤特异性抗体吸 附或交联到载药毫微粒上,制备抗体导向的毫微粒即免疫毫微粒(Immunonanoparticles),将具 有载药量大、缓释药 物、主动靶向性抗癌作用等多种特性,是一种新型的肿瘤导向治疗制剂 [4-6]。我们将抗肝癌单克隆抗体HAb18与载米托蒽醌(Mitoxantrone,DHAQ)的 牛血清白蛋白毫微粒(DHAQ-BSA-NP)共价交联,构建了肝癌特异的免疫毫微粒(HAb18-D HA Q-BSA-NP)。本文报道了此免疫毫微粒的制备、体外免疫学结合特性及其选择性抗瘤作用 。

  1 材料与方法

  1.1 DHAQ-BSA-NP冻干品 本校药学院张志荣教授惠赠,批号981216,4 ℃保存备用。

  1.2 抗体 抗肝癌单克隆抗体HAb18由第四军医大学病理教研室陈志南教 授惠赠。抗SIgA单抗4E3纯品由本室自制,本研究中用作对照抗体。免抗小鼠IgG抗血清, FITC标记羊抗小鼠IgG抗体均为华美生物工程公司产品。

  1.3 主要试剂 异型双功能交联剂SPDP为CAL Biochem公司产品,用无水乙 醇配成浓度20 mmol/L;DTT为Serva公司产品; 3H-TdR为中科院上海原子核研究所 产品。

  1.4 细胞株 肝癌株SMMC-7721,本室保种传代;胃癌株SGC-7901,本校陈曼玲教授惠赠。

  1.5 单抗与毫微粒的交联 参照文献[4,7]方法加以改进。10 mg单抗经0.05 mol/L,pH7.5的PBS透析,加入SPDP 10 μl,于室温下搅拌30 min,过G-25 柱,用PBS洗脱,首峰即为纯化Ab-PDP,取毫微粒30 mg,超声匀化,同前加入SPDP,搅拌3 0 min,用0.05 mol/L pH4.5的醋酸缓冲 液离心洗涤以去除剩余SPDP,将沉淀(NP-PDP)分散于醋酸缓冲液,加入DTT(终浓度25 mmol /L),室温搅拌30 min,以还原NP-PDP,用PBS离心洗涤去除剩余DTT,得NP-PDP-SH。将A b-PDP和NP-PDP-SH混合,室温振荡20 h,用PBS离心洗涤数次,沉淀即为免疫毫微粒。

  1.6 免疫毫微粒的鉴定 玻片凝集试验,免疫荧光法均参照文献[5]方法进行。

  1.7 花环形成实验及花环形成阻断实验[8]  取SMMC-7721细胞悬液与不同浓度HAb18抗体混合 ,4℃作用30 min,用PBS离心洗涤细胞,加入HAb18-DHAQ-BSA-NP,室温振荡30 min,计算花环形成率。

  1.8 扫描电镜观察 参照文献[5]方法进行。

  1.9 免疫毫微粒与细胞结合的免疫荧光染色 同1.6制 备荧光免疫毫微粒(Fluorescent immunonano-particles)。在细胞悬液中加入等体 积荧光免疫毫微粒,4℃孵育30 min,PBS离心洗涤,荧光显微镜观察。

图1 免疫毫微粒HAb18-DHAQ-BSA-NP的玻片凝集反应

  Fig.1 Direct agglutination of immunonanoparticles (HAb18-DHAQ-BSA -NP)

  in the presence of rabbit anti-mouse IgG

  1.10 荧光染色阻断实验 取SMMC-7721细胞悬液与不同浓度HAb18抗体 混合,4℃作用30 min,洗涤,加入荧光免疫毫微粒(HAb18-DHAQ-BSA-NP),后续步骤同1.6

  1.11 免疫毫微粒的细胞毒试验 采用 3H-TdR掺入法,参照文献 [5]方法进行。洗去游离毫微粒后,继续培养细胞4 d。

  2 结果

  2.1 单抗与毫微粒的偶联 兔抗小鼠IgG抗血清加入后,原先分散均匀的免 疫 毫微粒形成凝集块(图1),而普通毫微粒仍处于均匀分散状态。FITC标记的二抗加入后,免 疫毫微粒表面发出明亮黄绿色荧光(图2),普通毫微粒未见荧光。上述结果证明,单抗(HAb1 8或4E3)已偶联到毫微粒上。

  2.2 免疫毫微粒与细胞的体外特异性结合 7721细胞周围结合有多个H Ab18-DHAQ-BSA-NP(图3),且结合的免疫毫微粒数量及花环形成与免疫毫微粒 /细胞比率成正比(图4), 当HAb18抗体(1.0,0.1 mg/ml)预先处理肝癌细胞后,能阻断H Ab 18-DHAQ-BSA-NP结合到肝癌细胞上,扫描电镜显示,多个HAb18-DH AQ-BSA-NP紧密结合在肝癌细胞表面(图5)。免疫荧光染色显示,发出明亮荧光的HAb18-D HAQ-BSA-NP包围在7721细胞周围形成花环(图6),当7721细胞经HAb18单抗(1.0,0.1 mg /ml) 处理后不能结合荧光免疫毫微粒(HAb18-DHAQ-BSA-NP),表现为荧光染色阴性。 证明HAb18-DHAQ-BSA-NP能有效特异性地结合肝癌细胞。

图2 免疫毫微粒(HAb18-DHAQ-BSA-NP)的免疫荧光染色

  Fig.2 Fluorescence staining of HAb18-DHAQ-BSA-NP

  with FITC labeled s heep anti-IgG

图3 HAb18-DHAQ-BSA-NP与SMMC-7721结合的光镜照片

  Fig.3 Light micrograph of the in vitro binding of HAb18-DHAQ-BSA-NP

  with SMMC-7721 cells

图4 花环形成率与HAb18-DHAQ-BSA-NP/7721细胞比值的关系

  Fig.4 Relationship between rosset formation and ratio

  of HAb18-DHAQ-B SA-NP to SMMC-7721 cells

图5 HAb18-DHAQ-BSA-NP与肝癌SMMC-7721细胞结合的扫描电镜照片

  Fig.5 Scaning electron micrograph of the in vitro binding

  of HAb18-D HAQ-BSA-NP with SMMC-7721 cells

图6 HAb18-DHAQ-BSA-NP与SMMC-7721细胞结合的免疫荧光染色

  Fig.6 Fluorescence labeling of SMMC-7721 cells by HAb18-DHAQ-BSA- NP

图7 免疫毫微粒对SMMC-7721细胞的体外杀伤作用

  Fig.7 In vitro killing effect of HAb18-DHAQ-BSA-NP,4E3-DHAQ-BS A-NP

  and DHAQ-BSA-NP on SMMC-7721 cells

  图8 免疫毫微粒对SGC-7901细胞的体外杀伤作用

  Fig.8 In vitro killing effect of HAb18-DHAQ-BSA-NP ,4E3-DHAQ-BSA -NP

  and DHAQ-BSA-NP on SGC-7901 cells

  2.3 免疫毫微粒的体外细胞毒作用 HAb18-DHAQ-BSA-NP对7721 细胞有 明显杀伤作用,且具有浓度依赖性,对SGC-7901细胞杀伤力很弱。4E3-DHAQ-BSA-NP及D HAQ-BSA-NP对这2株肿瘤细胞均无明显杀伤作用(图7,8),上述结果表明,免疫毫微粒HAb 18-DHAQ-BSA-NP对肝癌细胞具有特异性杀伤作用。

  3 讨论

  SPDP可应用于抗体与白蛋白毫微粒交联以制备免疫毫微粒。有用SPDP法成功地构建了膀 胱癌特异的白蛋白免疫毫微粒[4,5],我们在此基础上做了改进:原法是当抗体、 毫 微粒分别与SPDP反应生成Ab-PD或NP-PDP后,将Ab-PDP用DTT还原以形成Ab-PDP-SH,这 需要Ab-PD透析、浓缩,与DTT反应后,再次过G-25柱以去除剩余DTT等多个步骤;改进法 是在抗 体、毫微粒分别与SPDP反应生成Ab-PDP或NP-PDP后,将NP-PDP用DTT还原以形成NP-PDP-SH ,仅需几次简单的离心即可完成。 本实验采用多种免疫学方法,包括花环形成实验、扫描电镜 、免疫荧光法,充分证明HAb18-DHAQ-BSA-NP能良好地结合靶细胞;采用免疫学阻断实验 包 括花环形成阻断实验、免疫荧光染色阻断实验充分证明该免疫毫微粒与靶细胞结合的特异性 。此外免疫毫微粒的体外分布实验表明(资料未列出),HAb18单抗能改变毫微粒的分布,使 肝癌细胞能结合较多的毫微粒,这进一步证明免疫毫微粒HAb18-DHAQ-BSA-NP能有效地主 动靶向结合肝癌细胞。

  HAb18-DHAQ-BSA-NP选择性杀伤肝癌株的作用机理:免疫毫微粒与靶细胞孵育后洗涤, 游离部份被洗去,只有与靶细胞特异结合的免疫毫微粒保留下来。由于HAb18-DHAQ-BSA- NP结合能力良好,故洗涤后仍有大量HAb18-DHAQ-BSA-NP保持与靶细胞结合(光镜下明显 可见),最终表现出特异性杀伤效应。结合于靶细胞表面的免疫毫微粒杀伤靶细胞的方式未 明,有以下可能途径:免疫毫微粒缓慢释药,药物在靶细胞周围形成局部高浓度,药物 扩散入胞内,产生杀伤效应[6]。免疫毫微粒如同免疫脂质体经“内化”入靶细 胞内,在胞内释药产生杀伤作用[9]

  卫生部科学研究基金资助项目(No.98-1-225)及四川省卫生厅基金资助

  作者简介:刘晓波,男,34岁,博士生,主要从事肿瘤免疫研究;

  蔡美英,女,57岁,教授,博士生导师,主要从事肝病免疫研究

  4 参考文献

  1,徐希明,张多寿.毫微粒载体研究进展.药学进展,1998;22(3):133

  2,罗 兰,潘金火.微粒作为靶向制载体的研究进展.中国医药工业杂志,1998;29(9) :424

  3,Courveur P,Dubernet C.Controlled drug delivery with nanoparticles.Eur J Ph arm Biopharm,1995;41:2

  4,盛 洁,山登布卡,谢蜀生 et al.单克隆抗体BDI-1导向的阿霉素白蛋 白毫微粒对膀胱癌细胞的特异杀伤作用.药学药报,1995;30(9):706

  5,布 卡,盛 洁,谢蜀生 et al.抗膀胱癌免疫毫微粒的制备及活性检 测.中华微生物学和免疫学杂志,1996;6(1):54

  6,Leek C,Lee Y J,Kim W B et al.Monoclonal antibody-based targeti ng of methotrexate-loaded microspheres.Int J Pharm,1990;59:27

  7,Carlsson J,Drevin H,Axen P. Protein thiolation and reversible protein-prot ein conjugation.Biochem J,1978;173:723

  8,康继超,当木屯布卡,谢蜀生 et al.用免疫磁性微球从骨髓中分离癌 细胞. 药学学报,1998;33(1):52

  9,Huang A,Kennel S J,Huang L.Interactions of immunoliposomes with target cell . J Biochem,1983;258(22):140304

[收稿1999-04-15 修回1999-07-27]


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