慢性束缚致慢性疲劳动物模型的研制及其行为学观察

中国中医基础医学杂志 1999年第5期第5卷 实验研究

作者：王天芳　陈易新　季绍良　刘雁峰　李　峰　陈家旭　康纯洁　刘晓兰　刘　燕

单位：王天芳　陈易新　季绍良　刘雁峰　李　峰　陈家旭　康纯洁　刘晓兰　刘　燕(北京中医药大学中诊教研室　北京　100029)

关键词：慢性疲劳；动物模型；行为学观察

　　摘　要　目的　研制慢性疲劳动物模型，观测该模型动物的行为学变化以及中药的作用。方法　首次运用非体力及病毒感染因素制造慢性疲劳动物模型以及运用中药复方制剂进行治疗的研究。采用特制束缚筒造模，运用多种行为学方法检测判定。结果　模型组表现出活动减少、运动能力下降等典型的疲劳症状，记忆力下降。消疲怡神口服液与传统的强壮、抗疲劳药物人参(人参总甙)，均能显著改善各项成绩。结论　慢性束缚法能够制造出较为符合CFS诊断要求的慢性疲劳动物模型。消疲怡神口服液有显著的消除疲劳及改善相关症状的作用。

　　中图分类号　Q95—33

　　慢性疲劳是临床上常见的症状，可见于多种疾病。1988年美国疾病控制中心(CDC)将以原发的慢性疲劳为主要特征的症侯群命名为慢性疲劳综合征(CFS)^［1］，并拟定了相应的诊断标准，之后出现很多关于本病的报道。目前，关于CFS的病理机制尚不明确，但很多临床报道与研究表明，慢性疲劳的患者多伴有不同程度的精神神经症状、睡眠紊乱及免疫功能的紊乱。并认为该病的发生与长期精神刺激、脑、体力过度劳累等应激因素有关。而这些因素随着现代社会竞争的日趋激烈，对人类的影响愈加明显。因此，CDC预测CFS将成为21世纪影响人类健康的一个重要问题。为了进一步探讨慢性疲劳的发病机理及研制有效的中药制剂，本研究根据CFS的发病特征与临床表现、中医关于慢性疲劳的认识及现代医学的应激学说，拟用特制束缚筒，以慢性束缚法研制大鼠的慢性疲劳模型，并从行为学角度对模型及中药复方的治疗作用进行评定。

　　材料与方法

　　1　实验动物

　　二级Wistar雄性大鼠，体重160g～180g，由流行病研究所实验动物中心提供。

　　2　实验药物

　　消疲怡神口服液　由黄芪、枳壳、人参、柴胡、陈皮等药组成。委托北京永定制药厂加工，批号：960928。规格：10ml/支，相当于每毫升含生药1g。

　　人参皂甙片　中美合资吉林省亚威制药有限公司生产，吉卫药准字，批号94032019。规格：0.1g/片，含人参总皂甙25mg/片。

　　3　实验器材

　　造模用具　用硬塑料特制的束缚筒。该筒为管状，长20cm，筒口外径6cm，内径5.3cm，筒内前端置一直径略小于筒的内径、并可以前后调节的无底、圆嘴玻璃瓶，其瓶口为通气口(距离筒口5cm左右)，后端为可开关闸门。大鼠头向通气口置入后，关闭闸门，可通过调节玻璃瓶改变大鼠的活动空间。

　　开阔箱　本室依有关文献制作^［5、6］。

　　水迷宫　中国医学科学院药物研究所研制。

　　游泳池、秒表、温度计。

　　方法

　　1　动物分组及造模方法

　　动物饲养于室温为22±2℃正常光照的清洁级动物室中，5只/笼。适应2d后，将45只大鼠随机分为正常对照组(An=11);模型组(Bn=11)；模型加中药复方组(Cn=12,简称中药复方组)；模型加人参皂甙组(Dn=11,简称人参皂甙组)。第3d开始造模，持续2周。造模期间，每天将B、C、D组束缚一次，每次束缚过程三组同步进行。每天束缚开始时间不同，随机确定。每次束缚时，使动物钻进束缚筒内，并调节到其不产生强烈反抗的紧张程度，平架在木板上。3h后，三组动物同步取出。在整个束缚过程中，A组动物在同一环境中，但不予以进食水。造模结束后，立即开始行为学方面的测定。

　　2　给药方法

　　每次开始造模前1h给4组大鼠灌胃。A、B组予以单蒸水，C组予以中药复方“消疲怡神口服液”5g/(Kg^．d)，D组予以阳性对照药“人参皂甙片”(配制成水溶液70mg/Kg^．d)，各组灌胃容积均为3mL。

　　3　行为学观测内容及方法

　　分别观测大鼠的一般情况、学习记忆情况(水迷路)、探究行为及情绪反应(旷场及鼠尾悬挂实验)、体力情况(力竭游泳及鼠尾悬挂实验)。

　　3.1　一般情况观察

　　在2周造模期间，每天观察并记录大鼠的饮水量、进食量、体重以及大鼠粪便情况、鼠毛色泽和眯眼等。

　　3.2　学习记忆情况的观测

　　实验所用水迷宫^［3，4］用茶色有机玻璃制成，结构如图1所示。实验中水深为19cm，水温28℃±1℃。造模前一天，训练大鼠学习如何出离迷宫。将大鼠置于A处，稍加引导令其从D处(目标区，此处有一爬梯)出离迷宫。休息20秒后，再重复两次。之后，依次在B、C处进行上述训练(休息时间分别为30秒和40秒)。最后将大鼠放在迷宫起始端C处(起步区)，记录从C处到D处的时间，为其出离迷宫时间，以此作为大鼠学习成绩，在造模结束后第一天测试各组大鼠出离迷宫时间，以此作为大鼠记忆成绩(本实验在本校病理教研室的动物行为观测室进行)。

图1　

　　3.3　旷场实验(开阔法)^［5、6］

　　本实验于造模结束后第3天进行。将大鼠放入开阔箱的正中格内，观察大鼠6分钟的活动情况。测定指标包括：(1)正中央格停留时间：(2)方格间穿行次数(三爪以上跨入邻格的次数)；(3)竖起或修饰次数(两前肢离地1cm以上的次数)；(4)竖起或修饰时间(两前肢离地1cm以上的时间)。

　　3.4　鼠尾悬挂实验^［7］

　　本实验于造模结束后第1天进行。具体操作为将大白鼠尾端1cm的部位贴在一水平木板上(木板离地1m左右)，使动物呈倒挂状。悬挂两侧用板隔开动物视线，动物为克服不正常的体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性“不动”显示“失望”状态。计算6min内的不动时间，并同时观察大鼠挣扎幅度及抑郁状态。

　　3.5　力竭游泳实验^［8～11］

　　本实验在造模结束后第2d进行。游泳池的规格为185cm×58cm×73cm，游泳时水深为50cm、水温28℃±1℃，将事先标记好的大鼠同时置入游泳池，记录大鼠从入水到游泳至力竭(头部沉入水中10秒中不能浮出水面为力竭标准)的时间。

　　4　统计学方法　　实验结果均以平均值±标准差(x±s)表示，组间差异采用方差分析，用Duncan's检验。

　　结果

　　1　在造模期间，各组大鼠的饮水量、进食量、体重以及粪便、鼠毛色泽和眯眼等均无统计学差异

　　2　学习记忆情况

　　由表1可见，各组大鼠在造模前的学习成绩无统计学差异。经过两周慢性束缚，从各组大鼠出离水迷宫的时间看出，模型组的记忆成绩明显低于正常对照组、模型加中药复方组及模型加人参皂甙组。其中模型加中药复方组的成绩又略高于模型加人参皂甙组及正常对照组。

表1　慢性束缚对大鼠学习记忆的影响(单位：s,x±s)

　　注：^**与模型组比较：P＜0.01;*与模型组比较：P＜0.05。

　　3　旷场实验

　　如表2所示，模型组大鼠的穿行次数明显少于正常对照组、中药复方组及人参皂甙组，而后三组之间无明显差异，各组大鼠之间的修饰次数无明显差异。模型组大鼠的正中格停留时间明显高于人参皂甙组及中药复方组，与正常对照组无显著差异。模型组大鼠的修饰时间低于其他三组，并与人参皂甙组之间有显著性差异。

表2　慢性束缚对大鼠自发活动的影响(x±s)

　　注：**与模型组比较：P＜0.01；*与模型组比较：P＜0.05。

　　4　鼠尾悬挂实验

　　如表3所示，在悬尾悬挂实验中，模型组大鼠悬尾后的不动时间明显长于正常对照组、中药复方组及人参皂甙组，而在此三组中，以中药复方组的不动时间为最短。

　　5　力竭游泳实验

　　如表4所示，在力竭游泳实验中，模型组大鼠游泳至力竭的时间明显低于其他三组，而其他三组之间无显著差异。

表3　慢性束缚对大鼠悬尾不动时间的影响(x±s)

　　注：**与模型组比较：P＜0.01。

表4　慢性束缚对大鼠力竭时间的影响(x±s)

　　注：**与模型组比较：P＜0.01。

　　分析与讨论

　　国外的一些流行病学调查及临床报道表明，许多慢性疲劳患者在发病前曾有过长期精神紧张、不愉快的生活事件及生活习惯的改变等(也即与心理、社会等应激因素有关)，发病后常伴有精神抑郁或急躁易怒、健忘等精神神经症状、认知行为的改变及免疫功能紊乱等。我们根据临床所见及中医理论，认为慢性疲劳的发生与肝、脾两脏的关系最为密切，并提出肝脾功能失调为慢性疲劳发生的机理之一。因为肝主疏泄、主筋、调节情志，为“罢极之本”，脾主肌肉、四肢，与运动及疲劳的产生密切相关。临床上对于疲乏无力伴情志改变的患者，通过运用补气理气，调理肝脾的中药复方治疗，取得了较好的疗效。

　　基于中西医对于慢性疲劳发病机理的认识，本文首次采用自制的特定束缚筒，以慢性束缚法研制慢性疲劳动物模型。以往的研究多用一次性长时间的束缚研制大鼠的应激性溃疡动物模型^{［13～16］}或用于血清中免疫抑制因子的研究，在束缚过程中刺激强度往往比较大。我们根据大鼠喜钻洞的特性，应用特制的可调节束缚筒，进行为期2周的造模，并从行为学角度通过对大鼠的体力、情绪、记忆力等方面的观测而评定模型。

　　力竭游泳时间是反映动物体力及衡量动物是否疲劳的经典指标，鼠尾悬挂实验中动物的间断不动时间也能一定程度地反映动物的肌力。本实验表明，模型组动物在常温下游泳至力竭的时间明显低于正常对照组，而鼠尾悬挂实验中动物的间断不动时间明显长于正常对照组，说明经慢性束缚后动物的体力明显下降，体力活动中易于出现疲劳。旷场实验是较为经典的反应大鼠探究行为及情绪反应的方法，鼠尾悬挂实验也能反映动物的情绪。本实验通过评定大鼠对新环境的探索行为及自发活动次数，观察鼠尾悬挂实验中动物的间断不动时间，发现模型组动物的不动时间明显延长，穿格次数减少等，从而推断模型大鼠有抑郁倾向。水迷宫是反映大鼠学习、记忆能力的较为常用的实验方法，从各组大鼠出离水迷宫的时间看出，模型组的记忆成绩明显低于正常对照组，反映经慢性束缚后的动物记忆力明显下降。另外，造模2周后，各组体重、饮水量、进食量等一般情况均无统计学差异，说明本实验中动物的体力下降等与饮食、体重等因素无明显相关。

　　束缚主要通过使动物的躯体活动受限，而使大鼠产生挣扎、急躁、愤怒、抑郁、绝望等心理及行为变化。较长的造模周期与每天造模时间的不固定，可增强上述心理应激效果。该模型的行为学改变，可能是由于反复、长期的束缚，产生慢性应激，引起机体的功能紊乱，从而导致躯体及精神疲劳的发生。从中医角度来说，肝属木，性喜条达而恶抑郁，主疏泄，调节情志；脾主肌肉，与肌肉运动及疲劳的产生密切相关，肝的疏泄功能可影响脾的运化功能。束缚使动物肢体不得舒展，活动受限，产生不愉快的情绪改变，并且束缚过程中，动物肢体挣扎，劳伤筋脉、肌肉，最终导致肝脾功能失常，产生疲劳。造模过程中存在的生存环境的紧张、受限及愤怒、抑郁等情绪的变化，在一定程度与CFS发病的社会——心理因素相似。

　　本实验还表明具有补益、调理肝脾作用的消疲怡神口服液与对照药物人参总皂甙为目前研究最多的具有抗应激与抗疲劳作用的药物^{［8、9、10、18］}，均能显著逆转因慢性束缚所致的体力、记忆力的下降及抑郁倾向，从而说明消疲怡神口服液具有抗疲劳、抗应激的作用。其中消疲怡神口服液与人参总皂甙相比，在改善记忆力方面作用更为明显。

　　总之，基于中西医对于慢性疲劳产生机理的认识，运用慢性束缚法研制的模型，不仅出现了体力的下降(疲劳)，而且记忆力下降，自发活动减少，有抑郁倾向，与慢性疲劳的临床表现相近似，加之造模方法简便，可为今后进一步研究慢性疲劳的机理，评价抗疲劳药物的疗效提供一定的依据。

　　*　国家中医药管理局及国家自然科学基金资助课题

　　作者单位：王天芳　陈易新　季绍良　刘雁峰　李　峰　陈家旭　康纯洁　刘晓兰　刘　燕

　　(北京中医药大学中诊教研室　北京　100029)

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(收稿日期　1998—08—12　修回日期　1998—01—24)