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肝细胞的大量制备技术
[ 中医中药秘方网 作者:彭齐荣 ]

肝细胞的大量制备技术

  我们建立了一种大量分离肝细胞的新方法:半原位酶分离技术,与直接法和原位胶原酶灌流法(Seglen灌流法)比较,以该方法分离肝细胞,其细胞的收获量与成活率显著提高,且具有流程短,操作简便,胶原酶用量少,不需要特殊设备等优点。

  一、材料与方法

  1.材料及准备:SD大鼠,体重300~350g,由第一军医大学动物实验中心提供,试剂EDTA、Ⅳ型胶原酶为美国Sigma公司产品。为避免肝细胞粘附,减少肝细胞丢失,所有玻璃器皿均进行硅化处理。

  2.肝细胞分离:半原位酶分离技术,SD大鼠雄性,体重300~350g,3%苯巴比妥钠麻醉,肝素钠肝素化,常规消毒铺巾,沿正中线切开腹腔并暴露门静脉,将硅胶管针头端插入门静脉继以细线固定,硅胶管输液端与一次性输血器连接,后者连接输液瓶,先输注无钙镁Hanks液(含EDTA 1mmol/L)200ml,速度为30ml/min,肝脏变成肉色后,除保留门静脉外离断肝脏血管、韧带及系膜,将肝脏移入无菌平皿中,再输注含0.05%Ⅳ型胶原酶Hanks液100ml,输注速度为15ml/min,可回收平皿内的胶原酶液,视消化程度决定是否继续输注。液体温度为39℃。去除肝包膜及血管,钝性撕裂肝组织,以培养基溶解,多层纱布过滤,以50×g 3分钟反复离心洗涤3次,再以培养基制备成单个肝细胞悬液。

  3.肝细胞分离:直接法和Seglen灌流法,按文献[1,2]进行,其它同半原位酶分离技术。

  4.肝细胞产量及成活率的测定:按红细胞计数法计算每ml细胞悬液中的细胞数及细胞总数,即为肝细胞的收获量,用体积分数0.4%的台盼蓝等渗盐溶液与肝细胞悬液以1:9的比例混合,于混合后的1分钟内,在普通显微镜下观察,计算出未着色细胞数(即活细胞数)所占细胞总数的百分率,即为肝细胞的成活率。

  二、结果

  1.肝细胞产量及成活率:先后采用半原位酶法、直接法和Seglen灌注法分离大鼠肝细胞各10次,每次3只。计算肝细胞总收获量,其中一只肝脏的总收获量达4.41×108个(半原位酶法),肝细胞总收获量及活细胞率,结果见表1。分析表明,半原位酶法在肝细胞总收获量、成活细胞率及每100g体重活细胞量方面均显著高于Seglen灌注法(P<0.05)和直接法(P<0.01)。

  2.肝细胞限定培养前后的形态学观察:以半原位酶法分离的新鲜肝细胞在显微镜下呈单个分散状态,为具有立体感的圆球型,晶莹透亮,体积上大小一致(图1,见插页),对新分离的肝细胞进行台盼蓝排斥试验,结果显示绝大部分肝细胞的胞浆及核均排斥染色,整个细胞透明无色,少数损伤或死亡的细胞胞浆或胞核被台盼蓝染成蓝色(图2,见插页)。

  三、讨论

  直接法[1]是通过挤压、剪碎和震荡等机械手段,使肝细胞从肝组织脱落而获得,操作时间较长,加之机械损伤,其肝细胞收获量和细胞成活率远远低于Seglen灌注法[2]。Seglen灌注法是传统的肝细胞分离技术,但该技术仍存在操作烦琐、流程长、需要恒流循环灌注装置及胶原酶消耗量大等不足。我们以Seglen法为思路,建立的半原位酶分离技术分离肝细胞,其收获量与成活率高于目前的Selgen分离技术,且与Seglen法比较有如下优点:(1)以普通的一次性输血器替换恒流泵装置,通过旋扭控制输注速度,其调节方便,流量均匀,克服了蠕动泵安装复杂、间断性灌流的缺点。(2)改原位灌注为半原位灌注,即在原位灌注含EDTA的Hanks液,肝脏离体后灌注Ⅳ型胶原酶液,采用本法时胶原酶的用量仅为Seglen法的1/4,而Seglen法均在原位灌注,将消耗大量的胶原酶。(3)流程短、操作简便及不需要特殊设备。上述优点也可能是肝细胞收获量大和细胞成活率高的重要因素。

  参 考 文 献

  1. 吴喜贵,许霖水. 肝细胞的直接分离与培养. 第三军医大学学报,

  1996, 18: 169-170.

  2. Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Method cell Biol, 1976, 13: 29.

作者单位:第一军医大学南方医院全军消化病所

彭齐荣 袁爱力 赖卓胜 朱薇


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