肝细胞的大量制备技术

　　我们建立了一种大量分离肝细胞的新方法：半原位酶分离技术，与直接法和原位胶原酶灌流法(Seglen灌流法）比较，以该方法分离肝细胞，其细胞的收获量与成活率显著提高，且具有流程短，操作简便，胶原酶用量少，不需要特殊设备等优点。

　　一、材料与方法

　　1.材料及准备：SD大鼠，体重300～350g，由第一军医大学动物实验中心提供，试剂EDTA、Ⅳ型胶原酶为美国Sigma公司产品。为避免肝细胞粘附，减少肝细胞丢失，所有玻璃器皿均进行硅化处理。

　　2.肝细胞分离：半原位酶分离技术，SD大鼠雄性，体重300～350g，3%苯巴比妥钠麻醉，肝素钠肝素化，常规消毒铺巾，沿正中线切开腹腔并暴露门静脉，将硅胶管针头端插入门静脉继以细线固定，硅胶管输液端与一次性输血器连接，后者连接输液瓶，先输注无钙镁Hanks液（含EDTA 1mmol/L)200ml，速度为30ml/min，肝脏变成肉色后，除保留门静脉外离断肝脏血管、韧带及系膜，将肝脏移入无菌平皿中，再输注含0.05%Ⅳ型胶原酶Hanks液100ml，输注速度为15ml/min，可回收平皿内的胶原酶液，视消化程度决定是否继续输注。液体温度为39℃。去除肝包膜及血管，钝性撕裂肝组织，以培养基溶解，多层纱布过滤，以50×g 3分钟反复离心洗涤３次，再以培养基制备成单个肝细胞悬液。

　　3.肝细胞分离：直接法和Seglen灌流法，按文献[1,2]进行，其它同半原位酶分离技术。

　　4.肝细胞产量及成活率的测定：按红细胞计数法计算每ml细胞悬液中的细胞数及细胞总数，即为肝细胞的收获量，用体积分数0.4%的台盼蓝等渗盐溶液与肝细胞悬液以1:9的比例混合，于混合后的１分钟内，在普通显微镜下观察，计算出未着色细胞数（即活细胞数）所占细胞总数的百分率，即为肝细胞的成活率。

　　二、结果

　　1.肝细胞产量及成活率：先后采用半原位酶法、直接法和Seglen灌注法分离大鼠肝细胞各10次，每次3只。计算肝细胞总收获量，其中一只肝脏的总收获量达4.41×108个（半原位酶法），肝细胞总收获量及活细胞率，结果见表1。分析表明，半原位酶法在肝细胞总收获量、成活细胞率及每100g体重活细胞量方面均显著高于Seglen灌注法(P＜0.05)和直接法(P＜0.01)。

　　2.肝细胞限定培养前后的形态学观察：以半原位酶法分离的新鲜肝细胞在显微镜下呈单个分散状态，为具有立体感的圆球型，晶莹透亮，体积上大小一致（图1，见插页），对新分离的肝细胞进行台盼蓝排斥试验，结果显示绝大部分肝细胞的胞浆及核均排斥染色，整个细胞透明无色，少数损伤或死亡的细胞胞浆或胞核被台盼蓝染成蓝色（图2，见插页）。

　　三、讨论

　　直接法[1]是通过挤压、剪碎和震荡等机械手段，使肝细胞从肝组织脱落而获得，操作时间较长，加之机械损伤，其肝细胞收获量和细胞成活率远远低于Seglen灌注法[2]。Seglen灌注法是传统的肝细胞分离技术，但该技术仍存在操作烦琐、流程长、需要恒流循环灌注装置及胶原酶消耗量大等不足。我们以Seglen法为思路，建立的半原位酶分离技术分离肝细胞，其收获量与成活率高于目前的Selgen分离技术，且与Seglen法比较有如下优点：(1)以普通的一次性输血器替换恒流泵装置，通过旋扭控制输注速度，其调节方便，流量均匀，克服了蠕动泵安装复杂、间断性灌流的缺点。(2)改原位灌注为半原位灌注，即在原位灌注含EDTA的Hanks液，肝脏离体后灌注Ⅳ型胶原酶液，采用本法时胶原酶的用量仅为Seglen法的1/4，而Seglen法均在原位灌注，将消耗大量的胶原酶。(3)流程短、操作简便及不需要特殊设备。上述优点也可能是肝细胞收获量大和细胞成活率高的重要因素。

　　参 考 文 献

　　1. 吴喜贵，许霖水. 肝细胞的直接分离与培养. 第三军医大学学报,

　　1996, 18: 169-170.

　　2. Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Method cell Biol, 1976, 13: 29.

作者单位:第一军医大学南方医院全军消化病所

彭齐荣 袁爱力 赖卓胜 朱薇