胆囊结石胆汁、粘膜、结石幽门螺杆菌与结石核心形成的关系

世界华人消化杂志 1999年第3期第0卷 研究原著

作者：方驰华¹　杨继震¹　康惠广²

单位：¹第一军医大学珠江医院普外科　广东省广州市　510282；²解放军451医院　陕西省西安市　710054

关键词：胆结石/病因学；螺杆菌感染；螺杆菌，幽门

　　中国图书资料分类号　R657.4

　　摘　要

　　目的　探讨胆道幽门螺杆菌(Hp)感染在胆结石核心形成作用.

　　方法　采用聚合酶链式反应(PCR)检测胆囊结石70例胆汁、粘膜、结石和门静脉血Hp脱氧核糖核酸(DNA).

　　结果　检测70例，胆汁、粘膜、结石中Hp DNA存在分别为21例，12例(17.1%)和15例(21.4%).门静脉血中未检测出Hp DNA.

　　结论　胆道Hp感染是来自十二指肠乳头逆流.胆囊结石形成可能与Hp感染有关.

　　A PCR study on Hp DNA of bile,

　　relation to stone nuclear formation

　　FANG Chi-Hua¹, YANG Ji-Zhen¹ and KANG hui-Guang²¹Department of General Surgery, Zhujiang hospital, First Military Medical University, guangzhou 510282, Guangdong Province, China²Chinese PLA 451 Hospital, Xi'an 710054, Shanxi province, China

　　Subject headings　cholelithiasis/etiology; helicobacter pylori infections; Helicobacter pylori

　　Abstract

　　mETHODS　Hp DNA of bile, mucosa, stone and portal vein blood was detected with pCR in 70 patients with gallstones.

　　rESULTS　Hp DNA in bile, mucosa, stone was positive in 21, 12and 15 patients respectively. Hp DNA wasn't found in portal vein blood.

　　cONCLUSION　Hp infection of biliary tract originated from regurgition in duodenal papilla. Gallstone nuclear formation may be related to Hp infection.

　　0　引言

　　幽门螺杆菌(Hp)是胃十二指肠溃疡和急、慢性胃炎的主要致病菌.随着分子生物学水平及技术发展，除胃窦部外，在牙龈、粪便和胃液均检测出Hp.对胆道Hp检测及Hp在胆结石发病机制中的作用报道甚少.我们采用聚合酶链式反应(PCR)对胆囊结石患者胆汁、粘膜、结石和门静脉血Hp脱氧核糖核酸(DNA)进行研究.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　单纯胆囊结石患者70例.男26例，女44例；年龄18岁～71岁，平均43.6岁±12.0岁 . 经B超检查明确诊断，同期施行腹腔镜胆囊切除术，患者近6mo来无急性发作史.

　　1.2　方法　完成腹腔镜胆囊切除，经剑突下孔取出脐静脉、扩张、插管、取血3mL～5mL，置无菌试管内，立即离心，取血清2mL～3mL.无菌注射器穿刺取胆汁3mL～5mL置于无菌试管内.切开胆囊，将胆囊粘膜和结石用生理盐水反复冲洗、浸泡.取粘膜0.8cm×0.8cm置于无菌器.将结石压碎，取中心部位结石置于无菌器. 4种标本置于-29℃保存，备测. hp，DNA引物及阳标对照来自解放军基因研究所(表1，2). ①处理液：蛋白酶K60mg/L，4.5g/L Triton X-100，PCR缓冲液，5000r/min离心，取上清液为PCR模板.②反应液：5×反应缓冲液5μL，混合10×dNTP 2.5μL，引物5.0μL，无菌双蒸水6.5μL，加入备用模板5.0μL无菌石蜡油30μL，Taq-DNA聚合酶.

表1　五种需氧菌引物

表2　五种厌氧菌引物

　　PCR-DNA扩增采用解放军基因研究所的DTC-3C型扩增仪.①胆汁：取胆汁60μL，处理液40μL混合后煮沸20min，14000r/min离心5min，取上清液5μL加入引物中，放入扩增仪进行循环，共38次，取扩增好引物13μL点样，琼脂糖、TAE电泳，并与阳标对照.②粘膜：用生理盐水反复冲冼、解冻，置入处理液100μL中，剪碎粘膜组织，置入水浴锅100℃中煮沸25min，14000r/min离心5min，取处理好的标本液5μL加入引物中，离心5min，放入扩增仪进行循环.其他同胆汁. ③结石：结石捣碎后加入处理液100μL，置入水浴锅100℃中煮沸20min，14000r/min离心5min，取上清液5μL加入引物中.其他同胆汁. ④门静脉血：取血清60μL、处理液40μL混匀后煮沸20min，离心5min，取上清液5μL加入引物中，其他同胆汁.2　结果

　　2.1　胆汁中Hp,DNA检测情况　检测Hp dNA 21例，单菌Hp DNA 2例，Hp DNA与其他需氧菌和厌氧菌DNA共同存在19例，其中Hp⁺大肠杆菌3例，Hp⁺克雷伯杆菌2例，Hp⁺伤寒杆菌2例，Hp⁺伤寒杆菌+克雷伯杆菌2例，Hp⁺克雷伯杆菌+梭形芽孢杆菌、Hp⁺伤寒杆菌+脆弱类杆菌、Hp⁺伤寒杆菌+消化球菌、Hp⁺大肠杆菌+产气荚膜杆菌各1例. hp⁺伤寒杆菌+大肠杆菌+变形杆菌、Hp⁺大肠杆菌+伤寒杆菌+克雷伯杆菌、Hp⁺大肠杆菌+变形杆菌+产气荚膜杆菌、Hp⁺大肠杆菌+脆弱类杆菌+产气荚膜杆菌各1例，Hp⁺大肠杆菌+变形杆菌+消化球菌+梭形芽孢杆菌2例.

　　2.2　粘膜中Hp DNA检测结果　检测Hp DNA 12例，单菌Hp dNA 2例，Hp DNA与其他需氧菌和厌氧菌DNA共同存在10例，其中Hp⁺伤寒杆菌2例，Hp⁺消化球菌、Hp⁺梭形芽孢杆菌、Hp⁺产气荚膜杆菌各1例，Hp⁺梭形芽孢杆菌+产气荚膜杆菌、Hp⁺伤寒杆菌+产气荚膜杆菌、Hp⁺脆弱类杆菌+消化球菌各1例，Hp⁺伤寒杆菌+消化球菌2例.

　　2.3　结石中Hp DNA检测结果　检测Hp DNA 15例，单Hp dNA 7例，Hp DNA与其他需氧菌和厌氧菌DNA共同存在8例，其中Hp⁺大肠杆菌2例，Hp⁺伤寒杆菌、Hp⁺消化球菌各1例，Hp⁺梭形芽孢杆菌+产气荚膜杆菌1例，Hp⁺伤寒杆菌+克雷伯杆菌2例，Hp⁺消化球菌+梭形芽孢杆菌+产气荚膜杆菌1例.

　　门静脉血中未检测出Hp DNA.

　　3　讨论

　　已知在生理浓度下的胆酸在体外能抑制肠道各种细菌生长^［1］. hp是一种G^-的微需氧菌，在体外对鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸敏感，在某些疾病情况下，这些抑制Hp生长的因素可能改变^［2］.为了确定Hp感染是否与人类的胆囊炎有关，Fox et al^［3］采用特殊Hp16S rRNA引物进行PCR分析，研究了慢性胆囊炎患者的胆汁和胆囊组织，发现Hp dNA分别为56.5%和39.1%. 但没有见到有关胆囊结石Hp DNA报道.我们不仅研究了胆囊结石Hp DNA，而且同步研究了胆汁、粘膜和门静脉血Hp dNA，除门静脉血外，其他三种标本均检测出Hp DNA^［4］.证明Hp来自十二指肠乳头逆流. 由此可见，PCR对胆道感染细菌检测、细菌来源有重要意义.

　　采用分子生物学手段，目前已从胆汁、胆囊组织中分离和鉴定出胆囊螺杆菌(Hc)、肝脏螺杆菌(Hh)和Hp^［5］，在体外研究发现，Hh能抵抗高水平胆汁，所以该菌能在胆道移生. hh感染导致肝脏损害机制不清楚，但Hh能表达产生氨基酸的尿素酶，这种毒素产物可能损害肝细胞，此外，从Hh鉴定出一种损害肝细胞可溶性毒素.在小鼠中，Hh感染后发展肝脏慢性炎症，卵园细胞、枯否细胞增生，肝脏肿大和胆管增生^［3］. hc感染的特征是胆管增生伴有中性粒细胞和淋巴细胞浸润，有时在增生胆管和上皮细胞之间聚积炎性细胞，感染的肝脏含有广泛胆管增生和胆管周围纤维化^［6］. hp能产生脂多糖、细胞毒素和多种酶类物质，导致炎性细胞浸润、细胞变性坏死^［7］.在人类，这些特殊螺杆菌能诱导胆管损伤、慢性炎症、增生等^［3］.本研究中，不仅胆汁、粘膜中Hp DNA分别为30.0%，17.1%，而且在结石中Hp dNA高达21.4%，说明该菌与结石核心形成有密切关系.具体机制有待进一步研究.

　　作者简介：方驰华，男，1958-06-20生，湖北省汉川市人，汉族. 1981年空军高等专科医学大专毕业，1994年同济医科大学肝胆外科硕士，副主任医师，主攻胆道外科尤其梗阻性黄疸基础、临床及手术、腹腔镜外科和重症急性胰腺炎，发表论文243篇，参编专著1部，获全军科技奖15项.

　　通讯作者　方驰华，510282，第一军医大学珠江医院普外科，广东省广州市工业大道253号.

　　Correspondence to:FANG Chi-Hua, Department of General Surgery, zhujiang Hospital, 253 Gongye Avenue, Guangzhou 510282, Guangdong Province, china

　　tel. +86·20·84339888 ext. 43116 (H)

　　4　参考文献

　　［1］　Williams RC, Showalter R, Kern F. The effect of bile salt and cholestramine on intestinal anaerolic bacteria. Gastroenterology,1975;69:483-491

　　［2］ Lin TT, Yeh CT, Wu CS, Liaw YF. Detection and partial sequence analysis of Helicobacter pylori DNA in the bile samples. Dig dis Sci, 1995;40:2214-2219

　　［3］ Fox JG, Denhirst FE, Shen Z, Feng Y, Taylor NS, Paster BJ. Itepatic Helicobacter specises identified in bile and gallbladder tissue from chileans with chronic cholecystitis. Gastroenterology, 1998;114:755-763

　　［4］ 方驰华，康惠广.聚合酶链式反应对胆囊结石患者胆汁、粘膜、结石和门静脉血细菌同步研究.中华实验外科杂志，1998；15：318-319

　　［5］　Fox JG, Denhirst FE, Tully JG, Paster BJ, Yan L, Taylor NS. Helicobacter hepaticus sp.nov., a microaerophillic bacterium isolated from livers and intestinal mucosal scrapings from mice. J Clin Microbiol,1994;32:1238-1245

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　　［7］　连兆瑞，孔宪涛.幽门螺杆菌感染和胃粘膜免疫反应. 国外医学消化疾病分册，1991；11：68-70

收稿日期　1998-11-09