血清抗幽门螺杆菌抗体类型与相关疾病关系的研究

　　第二军医大学学报2000年第21卷第4期

屠振兴　龚燕芳　许国铭　丁华　满晓华　李兆申

　　摘　要　目的：分析中国人血清抗幽门螺杆菌(Hp)抗体类型，探讨其与疾病的关系。方法：收集143例血清，应用蛋白质印迹方法检测抗体类型。结果：患者血清中主要存在12.8万，11.6万，9.1万，8.7万，6.8万，6.6万，6.2万和3.5万等多条抗体带，其中以Hp6.6万最多见，高达91%。良性胃病与胃癌血清中前4条抗体带存在状态差别；但胃炎和消化性溃疡的血清类型无明显差别。结论：蛋白质印迹方法检测抗Hp抗体类型有助于良性胃病与胃癌的鉴别诊断。

　　关键词：幽门螺杆菌；抗体；印迹法，蛋白质；胃疾病

　　幽门螺杆菌（Hp）是慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病菌，且与胃癌、胃淋巴瘤的发生发展有关。作为无创伤性诊断方法，血清抗Hp抗体测定有一定的临床意义，敏感性可达80～90%。但存在着交叉反应，特异性不高。为了寻找Hp血清学检查较好的方法，文献曾应用蛋白质印迹方法分析Hp感染者血清抗体类型，并探讨了这些抗体和相关胃肠病的关系^［1］。鉴于东西方Hp菌株的差异，文献报道结果是否适用于我国患者不能定论。为此，本研究应用中国人临床分离Hp菌株作为抗原，对患者血清抗体类型进行分析，报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　临床资料　143例患者均在长海医院消化内科经内镜检查、活检标本尿素酶试验、组织学检查确诊者。男性85例，女性58例，年龄28～81岁。慢性胃炎75例（浅表性胃炎37例，糜烂性胃炎20例，萎缩性胃炎18例）；消化性溃疡41例（十二指肠溃疡21例，胃溃疡13例，复合性溃疡7例）；胃癌19例；贲门癌8例。

　　1.2　Hp菌株培养和抗原抽提　根据我们以前对Hp cagA、vacA分析结果^［2］，选择cagA阳性、vacA s1/m 1型和cagA阳性、vacA s1/m 2型两个临床菌株，置含10%小牛血清的TSB培养基中在微需氧环境下,37℃培养48 h。离心收集细菌后，用无菌盐水冲洗，再悬于0.15 mol/L NaCl中。应用超声波粉碎细菌。15000×g离心15 min，上清用0.15 mol/L NaCl透析48 h，测蛋白浓度，备用。

　　1.3　血清抗Hp抗体测定　应用上海建利科技实业有限公司出品的定量检测抗Hp igG试剂盒测定血清抗Hp抗体滴度。

　　1.4　蛋白质印迹试验　抗原抽提物加样本缓冲液，100℃煮沸10 min，行10% SDS聚丙酰胺凝胶电泳，每孔上样1 mg蛋白。电泳结束后，通过电转移方法将蛋白转移到硝酸纤维薄膜。硝酸纤维薄膜条与患者血清在37℃共同孵育30 min，用Tris缓冲液洗涤4次，再与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG置37℃共同孵育30 min。充分洗涤后加过氧化氢和二氨基联苯胺显色。待显色清晰后，加酸性溶液终止反应，用水冲洗后判断。显色带相对分子质量根据标准分子质量迁移率计算。

　　2　结　果

　　2.1　血清抗Hp IgG滴度　143例患者血清抗Hp igG滴度为20～108 U/m，其中50～80 U/m者占90%，抗体滴度与相关胃肠病无关。

　　2.2　抗体类型　143例血清可检出1～20条带（图1），平均为8.5个条带。6.6万带出现最多，高达91%；其次为11.6万带;出现率达63%；12.8万、9.1万和6.8万带出现率均为54%;8.7万和6.2万带出现率为47%和46%；4.2万和3.5万带出现率约30%；出现率低的条带有11万、10万、7.5万、5.6万、2.6万等。

图 1　Hp感染患者血清抗Hp抗体类型

　　fig 1　Pattern of serum antibody against

　　hp antigen in patients with Hp infection

　　2.3　抗体类型和Hp相关胃肠疾病之间的关系　不同Hp相关胃肠疾病患者的血清抗体主要条带出现频率见表1。对疾病可能有鉴别意义的条带有以下几个：(1)12.8万和11.6万带： 116例各种慢性胃炎、消化性溃疡患者的血清中71例（61%）同时存在12.8万和12.6万带，9例（8%）单独出现12.8万带，无1例单独出现11.6万带。相反，19例胃癌中只有1例（5%）同时存在12.8万和11.6万带，7例（37%）单独出现11.6万带，两者差别显著。5例单纯贲门癌未见此2个条带；而贲门癌合并浅表性胃炎3例中2例见此2条带，类似于慢性胃炎者；(2)9.1万和8.7万带：胃炎、消化性溃疡中68%（79/116）存在9.1万带，36%（42/116）有8.7万带；而胃癌中仅11%（2/19）存在9.1万带，却有84%（16/19）出现8.7万带，两者差别也明显；而且萎缩性胃炎8.7万带出现率为61%（11/18），高于其他良性疾病，接近胃癌患者；5例单纯贲门癌100%只出现9.1万带；而3例贲门癌合并浅表性胃炎者2例有9.1万带，1例有8.7万带，也类似于慢性胃炎者。(3)3.5万带:胃炎、消化性溃疡中30%（35/116）出现3.5万条带，而胃癌中16%（3/19）有3.5万带。

表 1　不同Hp相关疾病患者血清抗体条带的出现频率

　　tab 1　Frequencies of antibodies to Hp in human serum with different gastroenterological diseases

　　〔n（％）〕

　　SG:superfical gastritis; EG:erosive gastritis; AG:atrophy gastritis; DU:duodenal ulcer; GU:gastric ulcer; CU:compound ulcer; GC:gastric cancer; CC:cardia carcinoma3　讨　论

　　血清学检查抗Hp抗体被广泛用于Hp感染的诊断，因为有许多检测试剂盒可使用，还有患者在家自行检测的方法。多数方法有较满意的结果，敏感性可达80～90%。但存在着假阳性，特异性70%左右，需要进一步改进和完善。最方便的改进途径是选择较特异的抗原进行包被后检测。Nilsson等^［3］报道Hp感染患者存在11万，12万，2.6万，2.9万，3万，3.1万和3.3万抗原带。Faulde等^［4］报道13万，9.3万，7.5和6.7万4条带。Aucher等^［1］报道患者存在12.5万，8.7万，7.4万，6.6万，5.4万，4.8万，4.6万，4.2万，3.5万，3.0万，1.6万和1.4万等带。本结果表明，Hp感染患者的血清中，存在着多达20条抗Hp的抗体,出现较多的有12.8万，11.6万，9.1万，8.7万，6.8万，6.6万，6.2万，4.2万和3.5万等条带，最多的是6.6万带，达91%。这些条带差异与试验所采用的菌株不同有关,也可能与技术方法的差异有关。因此，若将蛋白质印迹法作为一种血清学诊断方法，必须将该法标准化，即选择比较明确的临床分离菌株制备抗原。文献报道，尿素酶的相对分子质量为6.6万,CagA和VacA的相对分子质量分别为12.5万和8.7万,热休克蛋白相对分子质量为5.4万^［1，5］。本结果提示，多数血清中含有抗CagA，VacA和尿素酶抗体，罕见抗热休克蛋白抗体，这可能与东西方菌株抗原存在差异所致。若将纯化的CagA，VacA和尿素酶作为混合抗原，或单纯尿素酶作为抗原，以ELISA法测定血清抗IgG，能否提高它的特异性，有待于进一步证实。

　　Hp感染可以导致许多相关疾病,文献曾对Hp相关疾病的严重性与抗体滴度，血清抗体特异性的相关性进行过探讨^［6,7］，结果不尽相同。认为血清抗体的多形性反映了免疫反应的演变和感染菌株的变迁。有人认为，抗CagA，VacA和3.5万抗体带与溃疡病有关，但我们的结果没有提示慢性胃炎和消化性溃疡血清抗体类型的差异；相反，提示胃癌与良性Hp相关胃病的抗体类型存在差异。胃癌血清中8.7万抗体带出现率明显高于胃炎和消化性溃疡患者，而12.8万和3.5万抗体条带出现率低于后者。更有趣的是，5例单纯贲门癌患者血清只有9.1万，6.6万，6.8万和6.2万4条抗体带，而3例贲门癌伴表浅性胃炎患者血清抗体类型与单纯表浅性胃炎患者相同。良恶性胃病血清抗体类型差异主要在12.8万，11.6万，9.1万和8.7万4条抗体带，它们的存在状态有助于良恶性胃病的鉴别诊断。这些抗原的性质有待于进一步研究。

　　参考文献

　　［1］Aucher P,Petit ML,Mannant pR,et al.Use of immunoblot assay to define serum antibody patterns associated with helicobacter pylori infection and with H.pylori-related ulcers［J］.J clin Microbiol,1998,36(4):931-936.

　　［2］侯　鹏，许国铭，龚燕芳，等.上海人幽门螺杆菌vacA基因表型与相关胃肠疾病［J］.中华内科杂志，1999,38(11):744-746.

　　［3］Nilsson I,Ljungh A,Aleljung P,et al.Immunoblot assay for serodiagnosis of helicobacter pylori infection［J］.J Clin Microbiol，1997,35(2):427-432.

　　［4］Faulde M,Schroder JP，Sobe D.Serodiagnosis of Helicobacter pylori infection by detection of immunoglobulin G antibodies using an immunoblot techenique and enzyme immunoassay［J］.Eur J Clin Microbiol Infect dis,1992,11(7):589-594.

　　［5］Dunn BE,Campbell GP,Perez-Preze GI,et al.Purification and characterization of urease from helicobacter pylori［J］.J Biol Chem，1990,265(16):9464-9469.

　　［6］Covvacci A,Censini SS,Bugnoli M,et al.Molecular characterization of the128-kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer［J］.Proc Natl Acad Sci uSA,1993,90(12):5791-5795.