幽门螺杆菌空泡毒作用—一种新发现的致病因素

中华医院感染学杂志 1999年第2期第9卷 论著

作者：施理　向友华　戴立人　侯晓华　易粹琼

单位：向友华　戴立人　侯晓华（易粹琼武汉同济医科大学附属协和医院　武汉　430022）；施理（广州同和南方医院）

　　关键词: 幽门螺杆菌；空泡毒作用

　　摘要　目的　用细胞毒实验对幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,HP)致病机制作进一步研究。方法　62株临床分离的幽门螺杆菌，43株的肉汤培养滤液(0.22um微孔滤膜)作用于体外培养的Vero细胞，能使其产生胞浆空泡样变。随着作用时间延长，空泡数目逐渐增多，体积逐渐增大，4天后细胞逐渐死亡。据此将HP分为有空泡毒作用的HP(Toxin+)及没有空泡毒作用的HP(Toxin-)。二类HP肉汤培养滤液的尿素酶活性无明显差异(P＞0.05)。结果　HP的这种空泡毒作用不同于已知的HP的致病因素，而是一种新近发现的致病因素。HP相关消化性溃疡、十二指肠球部溃疡、胃炎患者，HP(Toxin+)分别占其HP感染总数78.26%、84.38%、42.86%。结论　HP相关消化性溃疡与HP(Toxin+)感染密切相关。

　　中国图书资料分类法分类号　R377

The vacuole toxic effect induced by Helicobacter

　　pylori-One recently found pathogeny

　　Shi Li　Xiang Youhua　Dai Liren　Hou Xiaohua　Yi Suqiong

　　Department of Gastroenterology, Union Hospital,

　　Tongji Med ical University, Wuhan 430022

　　Abstract　OBJECTIVE Cytotoxic test was use d to further study the pathogeny of Helicobacter pylori (HP). METHODS HP strains were obtained by culture from patients Vero cell intracytoplasmic vacuolization was induced by Broth Culture Filtrate ( BCF, 0.22um pore filter) of 43 of 62 HP strains obtained from patients. The nu mber of vacuole increased and the size grew larger with the vacuolated toxin. Th e vacuolated Vero cells died after 4 days. On the basis of vacuolated toxicity, HP strains were divided into two groups, HP (Toxin +) and HP (Toxin -). RESULTS There was no significant difference (P＞0.05) of urease activity in the BCF betwee n HP (Toxin +) and HP (Toxin -). The vacuolated effect of HP (Toxin +), which wa s a pathogeny found recently, was different from the effects of HP measured eve r. The infective rate of HP (Toxin +) among the patients with HP-associated-pept ic ulcer, duodenal ulcer, gastritis were 78.26%, 84.38% and 42.86% separatel y. CONCLUSION HP (Toxin +) infection is a ssociated closely with peptic ulcer disease.

　　Key words　Helicobacter pylori　Vacuolation

　　自1983年Warren与Mashall^［1］从人胃粘膜分离出幽门螺杆菌(Helicobacterpylory,HP)后，HP与胃炎、消化性溃疡、胃癌^［2］之间的关系逐渐被人们接受，但HP的致病机理尚不十分明确。组织学、免疫荧光、超微病理研究表明，HP并非直接侵犯胃粘膜组织^［3］，提示HP的外毒素或代谢产物在HP的致病机理中起重要作用。1988年Leunk^［4］发现部分HP菌株在肉汤培养中，能产生一种使体外培养的哺乳细胞产生空泡样变的毒素，并据此将HP分为产空泡毒素的HP(Toxin+)及不产空泡毒素的HP(Tosin-)，并发现HP相关消化性溃疡患者大多感染的是HP(Toxin+)，而HP相关胃炎患者大多感染的是HP(Toxin-)，提示HP(Tosin+)较HP(Toxin-)致病力更强。动物试验也证实HP(Toxin+)能引起广泛而严重的炎症、縻烂甚至溃疡，而HP(Toxin-)或不能定植在胃粘膜上或仅引起较轻的炎症^［8］。国外对HP空泡毒作用研究正方兴未艾，而国内对其研究刚刚开始。本试验通过从临床分离的HP的培养滤液对Vero细胞是否产生空泡毒作用的研究，进一步探讨HP的致病机理。

　　1　材料与方法

　　1.1　病例选择　选择近期未服用De-Nol、H₂-受体拮抗剂、质子泵抑制剂等药物、接受胃镜检查的患者94例；男52例，平均年龄44.4±8.1(16～64)岁，女42例，平均年龄40.2±7.7(19～60)岁。94例中，患消化性溃疡59例、胃炎29例、胃癌6例。诊断以内镜结合病理检查为标准。内镜下，距幽门3～5cm、沿胃窦大小弯各钳取2块(大小弯各1块)胃粘膜；1份用于HP尿素酶试纸快速诊断HP，若为阳性，另一块则用划线接种法接种于改良布氏琼脂羊血培养基上。另外两块送病理检查。

　　1.2　HP分离培养、鉴定、培养滤液制备　将上述接种的平皿，置于厌氧罐中，在37℃、微需氧环境中培养7天。将培养出来的菌落，经肉眼观察、涂片革兰氏染色、鞭毛检查、生化鉴定，将证实是HP的单个菌落接种在含15%小牛血清的改良布氏肉汤中，在37℃、上述微需氧环境下培养1天，在恒温摇床上培养3天。当培养液浊度到达Mc4时，将培养液接种于HP选择性培养基上，按前述条件培养、鉴定。在证实为HP后，将上述培养液离心，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即成HP培养滤液。

　　1.3　HP培养滤液对Vero细胞的作用　将在培养瓶上生长良好的Vero细胞用0.25%胰酶溶液从瓶壁上消化下来，传到96孔细胞培养板，在二氧化碳培养箱内培养2天，在细胞有25%融合度时，倒去RPMI1640(Gibco公司出品)培养液，更换新的RPMI1640培养液。以倍比稀释法将HP培养滤液加入培养基内。每一个HP培养滤液做两个重复孔，并将未接种HP的改良布氏肉汤的滤液作为阴性对照。

　　1.4　观察指标及结果判定

　　1.4.1　培养体系pH测定　在培养开始24小时、48小时分别检测培养液的pH值。

　　1.4.2　HP培养滤液尿素酶活性测定　按Mobley介绍的方法测HP培养滤液的尿素酶活性^［8］：称取蛋白胨0.1克、氯化钠0.5克、葡萄糖0.1克、磷酸二氢钾0.2克、尿素10克、酚红2克，加双蒸水至100ml，即为尿素酶作用液。将HP培养滤液50ul加尿素酶作用液1ml，在37℃水浴箱中反应1分钟，用721分光光度计读取560nm处光密度值，以尿素酶反应液1ml作为空白对照，以二者光密度值差作为HP培养滤液的尿素酶活性。

　　1.4.3　空泡毒结果判定　将培养基加有HP培养滤液的Vero细胞培养两天后，在倒置显微镜下观察，若40%以上Vero细胞出现胞浆空泡样变化，则判为空泡毒试验阳性，HP培养滤液含空泡毒素Toxin，HP为空泡毒作用阳性HP(Toxin+)；出现阳性结果的最高稀释度为其空泡毒作用滴度。

　　1.5　统计方法　计数资料，HP(Toxin+)在各种HP相关性胃肠疾病中的感染情况，用χ²检验；计量资料，培养体系pH值、HP培养滤液尿素酶活性比较用t检验。

　　2　结　果

　　2.1　HP(Toxin+)相关性胃肠胃内疾病中的感染情况　我们从HP相关性疾病患者分离出62株HP，43株为空泡毒试验阳性HP(Toxin+)占69.35%，19株为空泡毒试验阴性HP(Toxin-)占30.65%。这二类HP在各种HP相关性疾病中的分布见表1。

表1　HP(Toxin+)在各种HP相关胃肠疾病中的分布

　　以上可知，HP相关消化性溃疡患者，大多数感染的是HP(Toxin+)，占78.26%；HP相关胃炎患者则较少感染HP(Toxin+)占42.86%；二者之间有显著性差异(P＜0.05)。尤其在HP相关十二指肠球部溃疡患者中，HP(Toxin+)占的比例更高(84.38%)，明显高于HP(Toxin+)在HP相关胃炎患者中感染的比例，二者之间有显著性差异(P＜0.05)。HP相关胃溃疡、复合性溃疡患者的HP(Toxin+)感染比例也高于HP相关胃炎HP(Toxin+)感染的比例(P＞0.05)。

　　2.2　HP(Toxin+)空泡毒作用滴度　大多数HP(Toxin+)空泡毒作用滴度小于1∶4。1株为1∶8，另1株为1∶16，是从十二指肠球部溃疡患者中分离出来的。

　　2.3　空泡毒作用观察　大多数HP(Toxin+)培养滤液作用Vero细胞8小时后，部分Vero细胞出现比较小的空泡，随培养时间增加，越来越多的Vero细胞呈现空泡样变，而且空泡数目逐渐增多，体积逐渐增大。两天后空泡毒作用最强，但Vero细胞仍贴壁生长；4天后细胞逐渐死亡，漂浮在培养液中。而作为阴性对照的未接种HP的改良布氏肉汤的滤液，加入贴覆有生长良好Vero细胞的细胞培养板，培养1d、4d，Vero细胞形态无明显改变。

　　2.4　加入HP培养滤液后培养体系的pH值(±1.96S.D.)　见表2。

表2　加入HP培养滤液后培养体系的pH值

　　加入HP培养滤液培养0小时、24小时、48小时，HP(Toxin+)与HP(Toxin-)两组pH值无显著性差异(P＞0.05)。在HP(Toxin+)组，加入培养滤液0小时、24小时、48小时，pH值在三者之间也无显著性差异(P＞0.05)。

　　2.5　两组培养滤液尿素酶活性比较　HP(Toxin+)组尿素酶活性0.042±0.0042，HP(Toxin-)组0.047±0.0036。3　讨　论

　　体外培养的哺乳细胞出现空泡样变，是培养体系生化特性发生变化(如pH变化等)、营养缺乏、毒素作用时，细胞表现的一种病理、生理现象。我们的研究表明，只有产空泡毒素的HP(Toxin+)肉汤培养滤液能使Vero细胞产生空泡；布氏肉汤及不产空泡毒素的HP(Toxin-)肉汤培养滤液没有此种作用。这表明空泡样变不是由营养缺乏引起的。我们也发现，HP(Tosin+)与HP(Toxin-)两组肉汤培养滤液加入Vero细胞培养体系，培养0小时、24小时、48小时，pH值无显著性变化(P＞0.05)；在各个时刻，两组培养体pH值之间也无显著性差异。说明空泡也不是由于培养体系生化特性变化引起的。故可能是由HP(Toxin+)培养滤液中由HP(Toxin+)产生的一种毒素引起的比较HP(Toxin+)、HP(Toxin-)两组培养滤液尿素酶活性，发现两组之间无显著性差异(P＞0.05)。表明这种毒素不同于HP的尿素酶，国外研究发现这是一种分子量为87KDa的蛋白质^［6］—空泡毒素抗原(Vacuolating tosinantigen,VacA)；其空泡毒作用还与另一种分子量为128KDa的蛋白质，即细胞毒素相关基因抗原(Cytotoxin-associatedgeneantigen,CagA)有关。VacA与尿素酶的分子生物学、生化、免疫特性完全不同，是一种新发现的毒素。按照能否分泌空泡毒素，将HP分为产空泡毒素的HP(Toxin+)及不产空泡毒素的HP(Toxin-)。

　　HP(Toxin+)培养滤液引起的Vero细胞空泡样变，随作用时间延长，越来越多的Vero细胞呈现空泡样变；而且空泡的体积逐渐增大，数目逐渐增多，表明空泡毒作用继续加重；而细胞两天后仍贴壁生长，表明空泡毒素对Vero细胞的毒性作用暂时是非致死性的；但出现空泡的细胞4天后逐渐死亡，表明出现空泡的细胞最终不可避免地死亡。国外研究发现，感染HP(Toxin+)的人胃上皮细胞也有类似的空泡形成，其血清、胃组织有抗空泡毒素的抗体^［6，9］，这表明HP(Toxin+)不但在体外，而且也在体内分泌空泡毒素，表明发挥空泡毒作用，并刺激机体产生相应的抗体。向Wistar大白鼠胃内灌注空泡毒素，也引起与感染HP(Toxin+)相似的病理变化，如腺体萎缩、多形核淋巴细胞浸润、胃上皮细胞空泡样变^［8］，表明了空泡毒素的致病作用。

　　我们的实验发现，HP相关消化性溃疡患者大多数感染的是HP(Toxin+)，占其HP感染总数的78.26%。而HP相关胃炎患者则较少感染HP(Toxin+)，占其HP感染总数的42.86%，两者之间有显著差异(P＜0.05)，表明HP(Toxin+)感染与消化性溃疡关系密切，与国外的研究相符^［6］。提示HP(Toxin+)较HP(Toxin-)致病力更强。国外动物试验也发现^［8］，HP(Toxin+)能定植在限菌猪胃粘膜上，或仅引起较轻的炎症、糜烂甚至溃疡，而或不能定植在胃粘膜上或仅引起较轻的炎症，表明HP(Toxin+)较HP(Toxin-)致病力更强。

　　参考文献

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(1998-06-17收稿　1998-12-04修回)