卡介苗素抗哮喘有效成分的分离及其药理作用研究

药物生物技术 1999年第4期第6卷 论文

作者：刘　煜　盛海林　吴梧桐　吴文俊

单位：刘煜　吴梧桐　吴文俊（中国药科大学生物制药学院，南京210009）；盛海林（中国药科大学数学教研室，南京210009）

关键词：卡介苗素，卡介菌多糖，分离纯化，药理活性

　　摘　要　卡介苗素具有平喘作用，主要含多糖和核酸两种组分，为明确其有效成分，将卡介苗素经核酸酶酶解，去除其中的核酸组成后，经Sephadex g-100柱层析分离纯化，得到一种白色粉末状多糖——卡介菌多糖（BCG-PSA）。该多糖经聚丙烯酰胺凝胶电泳，Sephadex g-200柱层析证实为均一成分。对BCG-PSA的化学组成分析表明，该多糖的分子量为1.705×10⁵，不含硫酸基和糖醛酸。经纸层析、薄层层析及气相层析确证，其单糖组成仅为D-葡萄糖，属均一多糖类。对BCG-PSA的药理研究表明，该多糖具有明显的免疫调节功能和平喘作用，且毒性很小，是卡介苗素抗哮喘的有效成分。

Isolation and Purification of antiasthma Composition

　　from BCG-PSN and Study on Its Pharmacological Properties

　　liu Yu, Sheng Hailin¹, Wu Wutong, Wu Wenjun(Biopharmaceutics College, China Pharmaceutical University , Nanjing 210009 ；¹Department of mathematics, China Pharmaceutical University , Nanji ng 210009)

　　Abstract The purification of BCG-polysaccharide-nucleic aci d (BCG-PSN) was described in this paper. Nucleic acid and protein composition was removed with nuclease an d trichloroacetic acid-butanol respectively. A white powder was got by Sephadex G -100 column chromatography. this white powder was BCG-polysaccharide (BCG-PS A). Examined with polyacrylamide gelelectrophoresis and Sephadex G-200 column chroma tography, the bCG-PSA was homogeneous. The analysis in BCG-PSA's chemical com position showed that its molecular weight was 1.705×10⁵. Its monosaccharide compos ition was D-glucose only confirmed by paper chromatography, TLC and gas chromat ography.

　　Key Words　BCG-PSN, BCG-PSA, Separation, Pharmacological activity

　　卡介苗素即卡介菌多糖核酸（BCG-PSN），是由卡介菌中分离提取得到的一种生物活性物质，主要含多糖和核酸两种组分，其中多糖占75%以上。作为一种免疫调节剂其注射剂早在1985年已被列入《生物制品试行规程》，但其进一步的纯化研究工作国内外尚未报道。

　　多糖类药物如研究较多的香菇多糖^［1，2］，褚苓多糖^［3］，银耳多糖等在免疫调节，抗凝，降血脂，抗肿瘤，抗辐射等方面都具有显著的药理活性，而对一些细菌多糖的研究还较少。卡介苗素是一种免疫调节物质，能提高T细胞的免疫功能并通过激活T细胞，促进白细胞介素（IL-1,2）等的生成以及产生多种免疫调节的淋巴因子，并能增强巨噬细胞的功能，提高机体免疫细胞杀伤细菌、病毒等病原体的能力及提高溶菌酶活力，发挥重要的抗感染作用，在临床上用于防治感冒、哮喘、慢支等，有效率达96.49%。本文研究了卡介苗素的分离纯化及其多糖组分的药理活性，旨在从卡介苗素中分离出一种均一的抗哮喘有效成分。

　　1　仪器与试剂

　　1．1　试剂

　　卡介苗素（BCG-PSA）由长沙九芝堂提供(商品名“斯奇康”)；核糖核酸酶为中国科学院上海生物化学研究所产品；脱氧核糖核酸酶为包头市生物化学制药厂产品；SephadexG-100,SephadexG-200为进口分装；基础液，氧化液，还原液，阿利新蓝染色液：（以上四种溶液按文献^［5］配制）；蓝色葡聚糖，标准分子量的Dextran为进口分装；

　　1．2　仪器

　　恒温水浴；721分光光度计；BS423型稳流稳压电泳仪；循环水泵；日本岛津（Shimadzu）GC-9A气相层析仪，记录仪为岛津（Shimadzu）C-R3A。

　　1．3　动物

　　昆明种小鼠、豚鼠由中国药科大学动物房提供

　　2　实验方法

　　2．1　卡介菌多糖半纯品的提取分离

　　取卡介苗素1g，以蒸馏水溶解定容至200ml，加Dnase、Rnase各5mg，于35.5℃保温20h，加入氯仿和正丁醇，振摇10min去蛋白，流水透析48h，80℃浓缩，加入预冷的95%乙醇，搅拌均匀，置4℃冰箱过夜，真空干燥得淡黄色粉末0.765g，即为半纯品。

　　2．2　卡介菌多糖的纯化

　　SephadexG-100层析柱（1.5×40cm）预先用0.02mol/LNaCl溶液平衡。取上述半纯品50mg，溶于2ml0.02mol/LNaCl溶液中，离心除去不溶物，上柱，用0.02mol/LNaCl溶液洗脱，分部收集，每管收集5ml，流速0.5ml/min。用蒽酮试剂比色法测定各管多糖含量^［4］，一直洗到多糖呈阴性反应。合并含糖部分，透析除盐，浓缩，乙醇沉淀，经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得卡介菌多糖组分（BCG-PSA）。

　　2．3　卡介菌多糖的纯度检查

　　2．3．1　凝胶柱层析　SephadexG-200层析柱（1.5×40cm），预先以0.02mol/LNaCl溶液平衡。取经SephadexG-100纯化所得多糖样品40mg，溶于1ml0.02mol/LNaCl溶液中，离心取上清，如前法收集多糖组分，绘制洗脱曲线。

　　2．3．2　聚丙烯酰胺凝胶电泳　胶浓为6%，缓冲液为0.025MpH9.0的硼砂液。样品为2mg/ml，每管进样20ul，电压110伏，每管电流量约2mA，电泳4小时，按文献^［5］方法以阿利新蓝染色。

　　2．4　卡介菌多糖的Mr测定

　　SephadexG-200层析柱（1.5×40cm），预先用0.02mol/LNaCl溶液平衡。取卡介菌多糖样品15mg，溶于1ml0.02mol/LNaCl溶液中，加入柱顶，用0.02mol/LNaCl溶液洗脱，流速0.5ml/min，按1ml/管分部收集，以蒽酮法测各管含糖量，以测定样品的洗脱高峰体积。同时用五种已知Mr的Dextran标准品（Mr分别为10，000、40，000、70，000、100，000、500，000），用兰色葡聚糖（Mr=2，000，000）测外水体积。

　　2．5　卡介菌多糖的基团分析

　　2．5．1　硫酸基的鉴定^［6］　取卡介菌多糖5mg，溶于1ml6mol/LHCl中，封管水解12h，滴加氯化钡试剂，观察有无沉淀产生。

　　2．5．2　糖醛酸分析　取卡介菌多糖溶液1ml（5mg/ml），按Bitter［7］的方法测定糖醛酸含量。

　　2．6　组成单糖的鉴定

　　2．6．1　纸层析　用慢速层析滤纸15×12cm²，层析点间距2.0cm，与相应的标准单糖样品作对照（D-葡萄糖、D-木糖、鼠李糖、L-阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖），用乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水（12∶3∶3∶2）为展开剂，室温展开15cm左右，晾干后用苯胺-邻苯二甲酸显色^［8］。

　　2．6．2　薄层层析　以硅胶GF254按常规方法铺板（15×20cm²），105℃活化30min备用，层析点间距为1.5cm，同样以上述各标准单糖样品作对照，展开剂、显色剂同纸层析。

　　2．6．3　气相层析　按文献^［9］方法，将多糖水解物和标准单糖制成还原乙酰化衍生物，进行气相层析。填充柱为5%OV-225/AW-DMCS-ChromosorbW80-100目，1.0×0.3mmid,柱温210℃，载气N₂40ml/min，氢火焰检测器，测定各样品的滞留时间。

　　2．7　卡介菌多糖的药理作用研究

　　2．7．1　平喘试验　取经测定引喘潜伏期合格^［10］的幼年豚鼠（体重≤200g）24只，雌雄各半，随机分成4组，连续口服给药10d，于d10给药后1h，按文献^［10］方法测豚鼠的引喘潜伏期，用t值法对结果进行统计学处理。

　　2．7．2　溶血素测定　取18～22g小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，按文献^［11］的方法测定半数溶血值HC₅₀。

　　2．7．3　二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应（DTH）　取18～22g小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，按文献^［12］的方法致敏、攻击，测鼠耳肿胀度、脾指数和胸腺指数，观察各组差异。

　　3　实验结果

　　3.1　卡介菌多糖的纯化

　　SephadexG-100柱层析洗脱曲线见图1。将卡介菌多糖组分经紫外扫描（400～200nm），260nm、280nm处均无特征吸收，表明核酸、蛋白组分已基本去除，结果见图2。

(1)BCG-ΡSA　(2)Nucleic acid component

　　fig 1　Separation of BCA-PSA on Sephadex G-100 column

Fig 2　Separation of BCA-PSA on Sephadex G-200 column

　　3.2　卡介菌多糖的纯度检查

　　3.2.1　凝胶柱层析　Sephadex G-200柱层析洗脱结果见图2，为一左右对称的单峰，表明该多糖为单一组分。

　　3.2.2　聚丙烯酰胺凝胶电泳　卡介菌多糖呈单一区带。

　　3.3　卡介菌多糖的Mr测定结果

　　外水体积V₀=18ml；五种已知Mr的Dextran标准品的洗脱高峰体积Ve分别为44ml，33ml,28ml,25ml,9ml,样品的洗脱高峰体积Ve为21ml。线性回归得回归方程为：Y=118.99-18.73X(r=0.9993)

　　由方程得样品的平均Mr为1.705×10⁵。

　　3．4　卡介菌多糖的基团分析

　　3.4.1　硫酸基的鉴定　无白色沉淀产生，表明不含硫酸基。

　　3.4.2　糖醛酸分析　按该法测定不含糖醛酸，属中性多糖。

　　3．5　组成单糖的鉴定

　　3.5.1　纸层析和薄层层析　由两层析图谱可见，样品呈一个点，其Rf值与葡萄糖标准品及L-阿拉伯糖标准品的相近。

　　3.5.2　气相层析　样品水解物的还原乙酰化衍生物仅出一个峰，滞留时间为12.07min，葡萄糖标准品的滞留时间为12.63min，L-阿拉伯糖的滞留时间为4.35min。因此，卡介菌多糖的单糖组成仅为D-葡萄糖。气相图谱见图3。

（1）D-glucose and L-arabinase

　　a. D-glucose b. L-arabinase(2) BCG-PSA

　　fig 3　The gas chromatography of BCG-PSA

　　3.6　卡介菌多糖的药理作用研究

　　3.6.1　平喘试验结果　平喘试验结果见表1。

Tab 1　The effect of BCG-PSA on prolonging asthmatic latency period

　　*** P＜0.01 (vs control group)

　　由表1可见：卡介菌多糖能显著地延长乙酰胆碱所致豚鼠支气管痉挛的潜伏期，有明显的平喘作用。

　　3.6.2　溶血素测定结果　溶血素测定结果见表2。

Tab 2　The effect of BCG-PSA on raising serum haemolysin

　　***P＜0.01 (vs control group)

　　由表2可见：卡介菌多糖能有效地提高免疫小鼠血清中溶血素的含量，能增强小鼠的特异性体液免疫功能。

　　3.6.3　二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应结果　二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应结果见表3。

Tab 3　The effect of BCG-PSA on mice's delayed allergy induced by DNFB

　　*** P＜0.01(vs control group )　　由表3可见：卡介菌多糖能显著降低小鼠右耳的肿胀度，减轻迟发型变态反应所致水肿。

　　4　结论与讨论

　　经对实验条件诸如温度、时间等的数学优化处理后的纯化条件，精制纯化得一白色粉末状物质，对硫酸-蒽酮试剂呈阳性反应，260nm、280nm紫外扫描无特征吸收，SephadexG-200呈单一洗脱峰，表明该样品为均一的多糖组分，其中的核酸组分已基本去除。对该多糖组分的化学研究结果表明，该多糖组分为均一组分，Mr约170000，其单糖组成仅为D-葡萄糖一种，属均多糖类。对其药理研究结果表明，该多糖具有免疫调节功能，能明显提高小鼠单核巨噬细胞系统的吞噬功能；能显著降低二硝基氟苯所致小鼠右耳肿胀度，减轻迟发型变态反应所致水肿，能有效提高免疫小鼠血清中溶血素的含量，增强小鼠特异性体液免疫功能。该多糖能显著延长乙酰胆碱所致豚鼠支气管痉挛的潜伏期，具有明显的平喘作用。据文献报道，由黄芪、褚苓中提取出的多糖组分中也有仅含葡萄糖组分的，其作用机理还有待于进一步研究探讨。

　　参考文献

　　1　沙静妹，毛洪奎.香菇菌多糖.中国药学杂志，1989，24（2）：116

　　2　汪友永.抗乙肝新药——猪苓多糖注射液.中国医院药学杂志，1992，12（10）：477

　　3　杨模坤.中草药的高分子活性成分.药学通报，1981，16（11）：29

　　4　徐秀兰主编.生物化学实验与指导.北京：中国医药科技出版社，1994，231

　　5　吴梧桐，余品华，夏尔宁，等.银耳孢子多糖TF-A、TF-B、TF-C的分离、纯化及组成单糖的鉴定.生物化学与生物物理学报，1984，16（4）：393

　　6　樊绘曾.刺参酸性粘多糖的分离及其理化性质.药学学报，1980，15（5）：263

　　7　BitterT.A modified uronic acid carbazole reaction. Anal B iochem，1962;4:330

　　8　柴田村治主编.纸色谱法及其应用.北京：科学出版社，1978，108

　　9　吴梧桐，陈琼华，徐碧如.银耳孢子多糖的分离和分析.真菌学报，1982，1（2）：119

　　10　中国卫生部药政司，新药临床前研究指导原则汇编，1993，80

　　11　中国卫生部药政司，新药临床前研究指导原则汇编，1993，132

　　12　中国卫生部药政司，新药临床前研究指导原则汇编，1993，135

收稿日期：1999-03-16